轉谷氨酰胺酶在凝固型麥冬酸奶中的應用研究

陳開霜，陳美芳，2，于 博，余海忠，吳進菊*

（1.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 441053；2.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524094）

轉谷氨酰胺酶在凝固型麥冬酸奶中的應用研究

陳開霜1，陳美芳1，2，于 博1，余海忠1，吳進菊1*

（1.湖北文理學院 化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 441053；2.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524094）

轉谷氨酰胺酶可催化蛋白發生交聯作用，從而改善酸奶的質構特性。在單因素試驗的基礎上，以感官評分為響應值，利用響應面法對凝固型麥冬酸奶工藝進行優化，構建數學回歸模型。結果表明，麥冬酸奶制作工藝的最佳條件為：轉谷氨酰胺酶添加量0.3 g/L，白砂糖添加量6%，麥冬提取液添加量9 mL/100 mL牛奶，發酵時間7 h，發酵溫度42℃。在此條件下，麥冬酸奶的持水力為93%，膠體脫水收縮敏感性為40.3%，硬度為494.19 g，稠度為2 055.63 g·s，粘結性為-161.83 g，粘性指數為-585.13 g·s，感官評分平均值為89.7分，本研究為麥冬酸奶的開發與生產提供了一定的研究基礎。

麥冬；轉谷氨酰胺酶；凝固型酸奶；響應面法

轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）可催化蛋白質賴氨酸上ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間結合反應，導致蛋白質（或多肽）分子內和分子間發生共價交聯，從而形成分子量更高的生物聚合物[1-2]。TG是蛋白類的凝膠增強劑，廣泛存在于人體、高級動物、魚類、植物和微生物[3-5]中。該酶是WAELSCH及其合作者在1958年首次發現的[6]，后來應用于食品、醫學及其他領域[7-10]，從而改善蛋白質的凝膠特性、乳化穩定性、成膜性能、增強肉制品的口感風味等[11-12]。近年來，TG在多個食品領域得到廣泛應用，包括肉制品[13-14]、水產品[15-16]、乳制品[17]、植物蛋白制品等[18]。

襄麥冬為百合科山麥冬屬，植物湖北麥冬的干燥塊根，屬于湖北省藥材，被收載于《中華人民共和國藥典》（1995年、2000年、2005年版）山麥冬這一項下，并且主產區位于襄陽市所在的老河口、襄城區歐廟鎮等縣市，稱為襄麥冬[19]。麥冬黃酮具有良好的抗炎、抗應激、抗組胺、心血管保護功能和磷酸化抑制等作用[20]，是襄麥冬的主要活性成分之一。2002年，麥冬被國家衛生部批準為可用于保健食品的物品（衛法監發[2002]51號）。

本研究是在單因素試驗的基礎上，以感官評分為響應值，利用響應面法對凝固型麥冬酸奶制作工藝進行優化。根據Box-Behnken試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面法分析以優化麥冬酸奶制作工藝，為麥冬酸奶的開發與生產提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛奶、白砂糖：購于襄陽市隆中路隆中鑫源超市；乳酸菌酸奶發酵劑（內含保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）：北京川秀科技有限公司；轉谷氨酰胺酶（100 U/g）：江蘇一鳴生物科技股份有限公司；麥冬：產于襄陽歐廟鎮。

1.2 儀器與設備

TDL-60B型低速臺式離心機：上海安婷科學儀器廠；PHS-25型實驗室pH計：上海今邁儀器儀表有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋、DNP-9162-1型電熱恒溫培養箱：金壇市榮華儀器制造有限公司；AR2130型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YP5002型電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；JYL-350型料理機：山東九陽小家電有限公司；8411型電動振篩機：上虞市道墟星峰儀器廠；100目標準篩：浙江上虞市道墟張興紗篩廠；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵、KQ-C型玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市予華儀器有限責任公司；TA-XTplus質構儀：英國StableMicroSystems；TV1800紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 麥冬酸奶制作工藝流程

1.3.2 麥冬提取液的制備

采用熱水浸提法，將干麥冬粉碎，過篩（100目），按料液比1∶10（g∶mL）加蒸餾水，浸泡150 min，90 ℃水浴加熱180 min，然后用真空泵進行抽濾，取其濾液，備用。

1.3.3 單因素試驗

在100mL純牛奶中分別加入麥冬提取液0、3mL、6mL、9 mL、12 mL、15 mL，白砂糖添加量5%、6%、7%、8%，水浴加熱到60℃時，攪拌均勻，經過90℃、10 min滅菌后冷卻至42℃，接種發酵菌種（按說明書中的量進行添加）并分別加入0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、0.9 g/L和1.1 g/L的TG，發酵6.0 h、6.5 h、7.0 h和7.5 h，置于0～4℃后熟24 h。每個實驗重復3次，對照為不加TG，考察麥冬提取液、白砂糖、TG添加量及發酵時間對酸奶品質的影響。

1.3.4 響應面法優化麥冬酸奶發酵工藝

選擇對酸奶品質影響較大的3個單因素（TG添加量，麥冬添加量和發酵時間），以感官評分為響應值，利用Design-Expert設計3因素3水平響應面試驗，并對數據進行回歸分析，預測凝固型麥冬酸奶的最佳制作工藝條件，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 酸奶發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for yogurt fermentation process optimization

1.3.5 酸奶品質測定方法

（1）質構特性的測定

利用TA-XTplus質構儀測定酸奶質構特性，選擇A-BE d-40探頭，距離10 mm，觸發力5.0 g，進行測樣，每測一次將探頭清洗干凈后擦干再測下一個樣品。

（2）持水力的測定

取20 mL酸奶置于離心管中，并測定樣品質量w，以4000r/min的轉速離心10min，取出后在室溫下靜置10min，除去上清液，測殘余物質量w0，酸奶持水力的計算公式如下：

（3）膠體脫水收縮敏感性的測定

分別從樣品中取約20g酸奶（w實），放在漏斗上過濾2h，稱取過濾所得清液的質量w，酸奶的膠體脫水收縮敏感性計算公式如下：

（4）感官品質的評定

從色澤、風味、組織狀態對酸奶進行評價，滿分為100分，酸奶感官評定標準如表2所示。

表2 酸奶感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of yogurt

（5）pH的測定

取后熟24 h的酸奶，用PHS-25型實驗室pH計依次測定各酸奶的pH值并記錄。

2 結果與分析

2.1 麥冬提取液添加量對酸奶品質的影響

將麥冬提取液分別按0、3mL、6mL、9mL、12mL、15mL加入100 mL純牛奶中，混合6%的白砂糖，加入1 g/L的發酵劑和TG 0.5 g/L，發酵6.5 h，后熟，測定酸奶的質構、持水力、膠體脫水收縮敏感性、pH和感官評分，結果分別如表3和表4所示。

表3 麥冬提取液添加量對酸奶質構的影響Table 3 Effect ofOphiopogon japonicus extract addition on yogurt texture

表4 麥冬提取液添加量對酸奶品質的影響Table 4 Effect ofOphiopogon japonicusextract addition on yogurt quality

通過質構儀A/BE的反擠壓裝置測定一系列力的變化可以反應出酸奶的不同特性[21]。粘結性中負的力值說明酸奶對活塞的附著性，即力的絕對值越大，酸奶粘性越大，一般較稠的酸奶粘性較大；正的力值和面積越大，說明內聚力越大、酸奶越稠，對活塞下壓時的抵抗力越大，也說明酸奶細膩度、爽滑性越差。從測試結果可以看出，正的峰值力越大，口感越粘稠，樣品越易粘探頭，這樣就能很好的把酸奶的口感品嘗結果量化。

由表3可知，隨著麥冬提取液添加量的增加，酸奶的質構特性呈現不規則的變化趨勢，相對而言麥冬提取液添加量為6 mL/100 mL牛奶和9 mL/100 mL牛奶時較好一些。由表4可知，酸奶的持水力隨著麥冬添加量的增加而降低，而收縮敏感性上升，考慮到在一定范圍內持水力越高，收縮敏感性越低，酸奶品質越好，結合感官評分，得出麥冬提取液添加量為9 mL/100 mL牛奶時，酸奶的品質最好。

2.2 白砂糖添加量對酸奶品質的影響

將白砂糖按5%、6%、7%和8%的添加量加入純牛奶中，麥冬提取液添加量為9 mL/100 mL牛奶，加入發酵劑和TG 0.5 g/L，發酵6.5 h，后熟，測得酸奶的質構、持水力、脫水收縮敏感性、pH和感官評分，考察白砂糖添加量對酸奶品質的影響，結果如表5和表6所示。

表5 白砂糖添加量對酸奶質構的影響Table 5 Effect of white granulated sugar addition on yogurt texture

表6 白砂糖添加量對酸奶品質的影響Table 6 Effect of white granulated sugar addition on yogurt quality

由表5可知，質構儀測得酸奶的硬度、稠度和粘結性都是隨著糖的添加量的增加而降低，但是粘性指數卻是先降低后上升。同時，由表6可知，隨著糖的添加量的增加，酸奶的持水力逐漸上升，而脫水收縮敏感性逐漸下降，這可能是因為糖的加入增加了酸奶的固形物含量，酸奶的固形物含量越高，持水力越大，膠體脫水收縮敏感性越小。另外，在酸奶加工過程中，需要糖的協助，才能使酸奶的口味變得酸甜可口，添加量過多或過少都會影響酸奶的口感，白砂糖的最佳添加量為6%。

2.3 發酵時間對酸奶品質的影響

將白砂糖按6%的比例加入純牛奶中，麥冬提取液添加量為9 mL/100 mL牛奶，加入發酵劑和TG 0.5 g/L，分別發酵6.0 h、6.5 h、7.0 h和7.5 h，測定酸奶的質構、持水力、脫水收縮敏感性、pH，并進行感官評分，考察發酵時間對酸奶品質的影響，結果如表7和表8所示。

表7 發酵時間對酸奶質構的影響Table 7 Effect of fermentation time on yogurt texture

表8 發酵時間對酸奶品質的影響Table 8 Effect of fermentation time on yogurt quality

由表7和表8可知，在6.0～7.5 h的發酵時間內，麥冬酸奶的硬度、稠度、粘結性和粘性指數相差都不大，非常接近，而酸奶的持水力隨著發酵時間的延長而逐漸升高，膠體脫水收縮敏感性隨著發酵時間的延長而降低，但發酵7.0 h和7.5 h的酸奶持水力和膠體脫水收縮敏感性差異不明顯。結合感官評分，發酵7.0 h時感官評分最高，所以綜合各方面的因素，發酵時間為7.0 h時酸奶品質最好。

2.4 TG添加量對酸奶品質的影響

在酸奶制作過程中分別加入0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、0.9 g/L和1.1 g/L TG酶，對照組為不加酶，測定酸奶的質構、持水力、脫水收縮敏感性、pH，并進行感官評分，考察TG添加量對麥冬酸奶品質的影響，結果如表9和表10所示。

表9 轉谷氨酰胺酶添加量對酸奶質構的影響Table 9 Effect of transglutaminase addition on yogurt texture

由表9可知，在0.3～1.1 g/L的范圍內，隨著TG添加量的增加，酸奶的硬度和稠度逐漸增大。而粘結性和粘性指數的絕對值逐漸下降。與對照組相比，TG的添加顯著提高了麥冬酸奶的硬度和稠度。而隨著TG添加量的增加，酸奶pH值逐漸增大，但差異并不明顯，特別是在添加量為0.5～1.1 g/L時，酸奶pH值幾乎相等。

表10 轉谷氨酰胺酶添加量對酸奶品質的影響Table 10 Effect of transglutaminase addition on yogurt quality

由表10可知，酸奶的持水力隨著TG添加量的增加逐漸降低，只有當添加量為0.3 g/L時，酸奶的持水力高于對照組，其他的添加量酸奶的持水力反而低于對照組。只有添加量為0.5g/L時，酸奶的脫水收縮敏感性高于對照組，而其他添加量均低于對照組。感官評分方面，當TG添加量為0.3 g/L和0.5 g/L時，得分最高，且高于對照組，而添加量高于0.5 g/L時，酸奶的組織狀態越來越緊密，彈性很強，失去了酸奶原本的口感特性。為了實際生產考慮，添加0.3 g/L TG的酸奶既可以改善酸奶品質，也可以適當降低生產成本，即最適宜的TG添加量為0.3 g/L。

2.5 響應面試驗設計方案結果及分析

2.5.1 響應面法試驗結果

選擇TG添加量、麥冬添加量和發酵時間進行3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗設計，試驗結果如表11所示。

表11 酸奶發酵工藝優化響應面試驗結果與分析Table 11 Results and analysis of response surface experiments for yogurt fermentation process optimization

利用Design-Expert軟件對表11的試驗數據進行多元回歸比擬，可得出感官評分對TG添加量、麥冬提取液添加量和發酵時間的二次多項回歸方程為Y=89.00-4.5A+0.13B-0.88C+2.50AB-2.50AC+5.25BC-12.13A2-9.88B2-7.87C2。模型的F=166.37，P＜0.000 1，表明該試驗所用的二次模型是極顯著的，失擬項P值為0.100 8＞0.05，對模型是有利的，無失擬因素存在。

2.5.2 方差分析

回歸模型方差分析見表12。由表12可知，一次項A、二次項A2、B2、C2、交互項AB、AC、BC對感官評分都有極顯著影響（P＜0.01）。因素B和因素C對感官評分沒有顯著影響（P＜0.05）。

表12 回歸模型方差分析Table 12 Variance analysis of regression model

2.5.3 最佳方案的預測和驗證

利用Design-Expert軟件進行回歸模型并預測凝固型麥冬酸奶制作工藝最佳方案為：TG添加量0.03 g/L，麥冬提取液添加量8.92 mL/100 mL牛奶，發酵時間6.98 h，同時酸奶的感官評分為89.4分。根據優化的最佳工藝條件，采用TG添加量0.03 g/L，麥冬提取液添加量9 mL/100 mL牛奶，發酵時間7 h的工藝條件制作麥冬酸奶，感官評分平均值為89.7分。由于預測值和驗證值很接近，而且相對誤差為0.33%，因此說明該模型的擬合程度較好，回歸方程和響應面法對酸奶品質的分析和預測是可行的。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化麥冬酸奶發酵條件，其最佳工藝為：TG添加量0.3 g/L，白砂糖添加量6%，麥冬提取液添加量9 mL/100 mL牛奶，發酵時間7h，發酵溫度為42℃。在此條件下，麥冬酸奶的持水力為93%，膠體脫水收縮敏感性為40.3%，硬度為494.19 g，稠度為2055.63g·s，粘結性為-161.83 g，粘性指數為-585.13 g·s，感官評分平均值為89.7分。試驗結果表明，在一定范圍內，加入TG可以改善凝固型麥冬酸奶的質構，提高持水力，降低膠體脫水收縮敏感性，使酸奶的感官品質提高。

[1]董建國，潘潤淑，王正榮，等.超高壓和轉谷氨酰胺酶對碎牛肉凝膠品質的影響[J].食品工業，2013，34（8）：171-175.

[2]張瑞萍，王曉燕.轉谷氨酰胺酶TGase對羊毛的吸附性分析[J].印染助劑，2014（12）：29-32.

[3]BINSI P K,SHAMASUNDAR B.Purification and characterisation of transglutaminase from four fish species:Effect of added transglutaminase on the viscoelastic behaviour of fish mince[J].Food Chem,2012,132(4):1922-1929.

[4]HAMDANI S,YAAKOUBI H,CARPENTIER R.Polyamines interaction with thylakoid proteinsduringstress[J].J Photochem Photobiol B,2011,104(2):314-319.

[5]KANAJI T,OZAKI H,TAKAO T,et al.Primary structure of microbial transglutaminase fromStreptoverticiliumstrain S-8112[J].J Biol Chem,1993,268:11565-11572.

[6]李增緒.谷氨酰胺轉氨酶在食品加工中的應用[J].食品研究與開發，2004，25（4）：3-5.

[7]REDA F M.Kinetic properties ofStreptomyces canariusL-glutaminase and its anticancer efficiency[J].J Microbiol,2015,46(4):957-968.

[8]LOHMANN R,SOUBA W W,BODE B P.Rat liver endothelial cell glutamine transporter and glutaminase expression contrast with parenchymal cells[J].Am J Physiol Gastr L,1999,276(3):743-750.

[9]MEISTER A.Glutamine synthetase from mammalian tissues[J].Method Enzymol,1985,113:185-199.

[10]ZHAO J,LOPEZ A L,ERICHSEN D,et al.Mitochondrial glutaminase enhancesextracellularglutamateproductioninHIV-1-infectedmacrophages:Linkage to HIV-1 associated dementia[J].J Neurochem,2004,88(1):169-180.

[11]吳進菊，宦忠麗，劉 果，等.轉谷氨酰胺酶在面包中的應用研究[J].中國食品添加劑，2016（9）：151-155.

[12]馬 瑩.轉谷氨酰胺酶協同殼寡糖修飾乳清蛋白性質研究[D].大連：大連工業大學，2016.

[13]張建國，劉孝沾.轉谷氨脫胺酶在肉制品中應用研究[J].肉類工業，2014（1）：50-53.

[14]孫英婷.TG酶及其他功能性添加物對豆腐腸質構特性的影響[D].南寧：廣西大學，2013.

[15]李艷青，孔保華，王 濤.轉谷氨酰胺酶在淡水魚制品中的應用[J].食品科技，2004（4）：40-42.

[16]張夢玲，張 晉，熊善柏，等.轉谷氨酰胺酶及其在魚糜制品加工中的應用[J].食品研究與開發，2016 ，37（24）：190-195

[17]張雪喜，王存芳，王建民.轉谷氨酰胺酶對乳蛋白的作用機理及其應用進展[J].乳業科學與技術，2016（3）：29-32.

[18]張海均，賈冬英，姚 開.轉谷氨酰胺酶在大豆蛋白及制品中的應用[J].糧食與飼料工業，2012（9）：19-21.

[19]田 宏，王蕾蕾.湖北麥冬的生藥鑒別[J].時珍國藥研究，1997，8（6）：525-526.

[20]余伯陽，殷 霞，徐國鈞，等.湖北麥冬與浙麥冬質量的研究—免疫活性比較[J].中國中藥雜志，1991，16（10）：584-585.

[21]紀宗亞.質構儀及其在食品檢測方面的應用[J].食品工程，2011（3）：22-25.

Application of transglutaminase inOphiopogon japonicusset yogurt

CHEN Kaishuang1,CHEN Meifang1,2,YU Bo1,YU Haizhong1,WU Jinju1*
(1.College of Chemical Engineering and Food Science,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;2.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524094,China)

Transglutaminase can catalyze protein cross-linking effect,and improve the texture characteristics of yogurt.On the basis of single factor experiments,the optimum conditions ofOphiopogon japonicusset yogurt were optimized by response surface methodology using sensory evaluation score as evaluation index,and then the mathematical regression models were established.Results showed that the optimum processing technology of O.japonicusyogurtwasasfollows:transglutaminase0.3g/L,granulatedsugar6%,O.japonicusextractsolution 9 ml/100 mlmilk,fermentation time 7 h,and temperature 42℃.In this conditions,the water-holding capacity was 93%,the collioid syneresis sensitivity was 40.3%,the firmness was 494.19 g,the consistency was 2 055.63 g·s,the cohesiveness was-161.83 g,the viscosity index was-585.13 g·s,and the average sensory score was 89.7.The research provided a certain basis for the development and production ofO.japonicusyogurt.

Ophiopogon japonicus;transglutaminase;set yogurt;response surface methodology

TS252.5

0254-5071（2017）09-0158-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.034

2017-03-27

湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃項目（T201616）；襄陽市科技局研究與開發計劃項目；湖北文理學院食品新型工業化學科群建設項目；湖北省普通本科高校“荊楚卓越人才”協同育人計劃項目

陳開霜（1996-），男，本科生，研究方向為食品加工高新技術。

*通訊作者：吳進菊（1983-），女，副教授，博士，研究方向為食品加工高新技術。