羊棲菜蛋白質提取及功能性研究

龐庭才，胡上英，范和良，黃 海，林麗丹

（1.欽州學院 廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西 欽州 535000；2.欽州學院廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室，廣西 欽州 535000；3.欽州學院 機械與船舶海洋工程學院，廣西 欽州 535000）

羊棲菜蛋白質提取及功能性研究

龐庭才1，2，胡上英3，范和良2，黃 海2，林麗丹2

（1.欽州學院 廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西 欽州 535000；2.欽州學院廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室，廣西 欽州 535000；3.欽州學院 機械與船舶海洋工程學院，廣西 欽州 535000）

以羊棲菜為原料，考察提取工藝對其蛋白質得率的影響，并研究羊棲菜蛋白質的功能特性。通過單因素試驗考察了液料比、堿質量分數、浸提溫度和浸提時間等4個因素，根據Box-Benhnken試驗設計和響應面分析法確定羊棲菜蛋白提取的最佳工藝條件。結果表明，羊棲菜蛋白的最佳提取條件為液料比21∶1（mL∶g），堿質量分數2.5%，浸提溫度57℃，浸提時間5 h。在此最佳工藝條件下，蛋白質得率為28.95%。羊棲菜蛋白的起泡性高達76.7%，優于大豆分離蛋白，而吸水性、吸油性、乳化能力、乳化穩定性、泡沫穩定性均不如大豆分離蛋白。

羊棲菜；蛋白質；提取；功能特性；響應面分析法

羊棲菜（Hizikia fusiformis）屬于褐藻門、馬尾藻科的一種海洋孢子植物，主要附生在基質上，是一種底棲附生生活型藻類。主要分布在我國浙江、福建、廣東等沿海地區[1]。羊棲菜營養豐富，富含有多糖、蛋白、食物纖維素、維生素以及微量元素等營養物質，在醫藥、食品以及化妝品等領域均具有較高的開發和利用價值[2]。蛋白質作為食物中的重要組成部分，被認為是人類所必需的第一營養素或生命素，占人體組成成分的45%[3]。無論動物或者人類都離不開蛋白質，但目前世界上約有1/5的人口缺乏蛋白質，蛋白質資源短缺及來源匱乏已是當今世界，特別是發展中國家亟需解決的問題[3-4]。長期以來，我國利用最廣泛的植物蛋白是大豆蛋白，其他蛋白質資源亟待開發，因此探索新的蛋白質資源具有重要的現實意義[4]。已有研究表明，鄭溫翔等[5]采用木瓜蛋白酶酶解的方法提取紫菜蛋白多肽，蛋白提取率為82%。劉立闖等[6]采用不同的方法提取螺旋藻蛋白行破碎，結果表明：超聲波法得到蛋白溶出率為71.51%，高壓均質法蛋白溶出率為73.87%，反復凍融法蛋白溶出率為72.03%。BERMEJO R等[7]采用陰離子交換樹脂層析柱純化螺旋藻藻藍蛋白，最終得率為9.6%。本研究采用堿溶酸沉法提取羊棲菜中的蛋白質[8]，通過單因素試驗考察液料比、堿質量分數、浸取時間和浸提溫度4個因素對蛋白得率的影響，并采用響應面法優化羊棲菜蛋白質的提取工藝，并研究羊棲菜蛋白質的功能性質，旨在為提高羊棲菜的綜合利用價值提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜：廣東雷州市市售；鹽酸、氫氧化鈉、四氯化碳、硫酸銅（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）：河南省柘城縣耕道貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4型恒溫水浴鍋：金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；BSA124S型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DHG-9030A型鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計：島津（中國）有限公司；TDL-5000-CR型離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 羊棲菜蛋白質提取工藝流程

1.3.2 羊棲菜蛋白質等電點的確定

稱取4.0 g羊棲菜樣品粉末，按照液料比10∶1（mL∶g），加入0.1 mol/L NaOH溶液，在60℃恒溫條件下浸提1 h，4 500 r/min離心10 min，過濾取上清液，用0.1 mol/L HCl溶液將提取液pH分別調節為4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，靜置20 min，3 000 r/min下離心15 min，取沉淀烘干至恒質量，沉淀最大時的pH即為羊棲菜蛋白質的等電點。

1.3.3 提取工藝優化單因素試驗

考察不同液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL∶g）），不同堿質量分數（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%），不同浸提溫度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃），不同浸提時間（1 h、3 h、5 h、7 h、9 h）對蛋白提取效果的影響。

1.3.4 提取工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，考察液料比（X1）、浸提時間（X2）、堿質量分數（X3）、浸提溫度（X4）對羊棲菜蛋白質提取效果的影響，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理進行響應面設計[9-10]，以蛋白得率為評價指標，對羊棲菜蛋白提取條件進行優化，響應面試驗因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 蛋白含量測定及得率計算

采用微量凱氏定氮法測定樣品中蛋白含量[11]；蛋白質得率計算公式如下：

1.3.6 羊棲菜蛋白功能特性評價方法

（1）吸水性的測定[12]

稱量0.5 g蛋白樣品m，加入5 mL蒸餾水V1置于離心管中，混勻1 min后，靜置30 min，在4 000 r/min離心30 min，測上清液的體積V2，則吸水性（WA）=（V1-V2）/m。

（2）吸油性的測定[12]

稱量0.5 g蛋白樣品m，加入5 mL花生油V1置于離心管中，混勻1 min后，靜置3 min，在4 000 r/min離心30 min，測上清液的體積V2，則吸油性（FA）=（V1-V2）/m。

（3）乳化性及乳化穩定性[13]

蛋白質乳化性的測定：稱取2.5g蛋白產品分散于50mL水中，加入50 mL大豆油，在2 000 r/min條件下勻漿1 min，1 200 r/min離心5 min，按下式計算其乳化能力：

蛋白質乳化穩定性的測定：將上述產品于80℃水浴加熱30 min后，冷水冷卻15 min，1 200 r/min離心5 min，按下式計算其乳化穩定性：

（4）起泡性及其泡沫穩定性[14]

稱量3 g蛋白產品和50 mL去離子水置于錐形瓶中，用0.1 moL/L NaOH或HCl調pH至中性，同時攪拌10 min，再加入100 mL去離子水作為測試液，以1 000 r/min快速攪拌3 min，記錄所產生的泡沫體積V0（mL），計算起泡性，然后靜置30 min，記錄所剩余的泡沫體積V30（mL），以此代表其泡沫穩定性。按下式計算起泡性和泡沫穩定性：

2 結果與分析

2.1 羊棲菜蛋白質等電點的確定

圖1 蛋白等電點的確定Fig.1 Determination of protein isoelectric point

由圖1可知，當羊棲菜蛋白提取液pH=5.0時，蛋白質沉淀量達到最大值，為1.21 g，由此可確定羊棲菜蛋白質的等電點（isoelectric point，pI）為5.0。

2.2 提取工藝優化單因素試驗結果

2.2.1 液料比對蛋白質得率的影響

圖2 不同液料比對蛋白得率的影響Fig.2 Effects of different liquid solid ratio on protein yield

由圖2可知，隨著液料比在10∶1～20∶1（mL∶g）范圍內增大，羊棲菜蛋白得率逐漸增大；液料比為20∶1（mL∶g）時，羊棲菜蛋白得率最大，為14.63%；當液料比＞20∶1（mL∶g）時，蛋白得率則呈下降趨勢。當液料比較低時，樣品中蛋白質不能充分溶解，隨著液料比增大，適合的物料濃度有助于物質的擴散。同時，液料比過大不僅造成成本增加，還會產生過多的廢液。因此，選取最佳液料比為20∶1（mL∶g）。

2.2.2 堿質量分數對蛋白質得率的影響

圖3 不同堿質量分數對蛋白得率的影響Fig.3 Effects of different alkali concentration on protein yield

由圖3可知，隨著堿質量分數在0.5%～2.5%范圍內增加，羊棲菜蛋白得率呈上升增加的趨勢；當堿質量分數達到2.5%時，蛋白得率達到最大值，為18.41%；之后即使堿質量分數繼續增大，蛋白得率反而緩慢下降。較低的堿質量分數，蛋白質-水相互作用增強，有利于羊棲菜蛋白溶解，過高的堿質量分數容易引起蛋白質脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應，使蛋白變性[15]。因此，選取最佳堿質量分數為2.5%。

2.2.3 浸提溫度對蛋白質得率的影響

由圖4可知，浸提溫度在30～60℃范圍內增加，羊棲菜蛋白得率隨之增大；浸提溫度為60℃時，羊棲菜蛋白得率最大，為17.37%；浸提溫度＞60℃時，羊棲菜蛋白得率隨之下降。可能的原因是隨著溫度升高，會增加蛋白質在提取溶液中的溶解度，而且高溫能使之前不完全破壁的細胞破裂，這樣能使蛋白質的溶解度增加；但當溫度過高時，蛋白質會發生變性，其內部結構發生改變[16]，使得蛋白溶解度下降，從而導致得率降低。因此，選取最佳浸提溫度為60℃。

圖4 不同浸提溫度對蛋白得率的影響Fig.4 Effects of different extraction temperature on protein yield

2.2.4 浸提時間對蛋白質得率的影響

由圖5可知，浸提時間在1～5 h范圍內增加，羊棲菜蛋白得率隨之增大；浸提時間達到5 h時，羊棲菜蛋白得率達到最大值，為14.67%；浸提時間＞5 h時，羊棲菜蛋白得率有所下降。浸提時間過短，蛋白質溶出不充分，反之浸提時間過長，樣品中其他物質可能與蛋白結合，亦不利于蛋白質的溶解。因此，選取最佳提取時間為5 h。

2.3 響應面試驗結果

以液料比（X1）、浸提時間（X2）、堿質量分數（X3）、浸提溫度（X4）為變量，蛋白質得率（Y）為響應值，設計響應面分析試驗，試驗方案及結果見表2，方差分析結果見表3。

利用Design Expert統計分析軟件對表3數據進行回歸擬合，得到二次回歸方程：

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖6 各因素交互作用對羊棲菜蛋白得率影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between various factors onH.fusiformisprotein yield

由表3可知，試驗所選的二次多項模型具有極高的顯著性（P＜0.000 1），決定系數R2=97.9%，說明響應值的變化有97.9%來源于所選變量，即料液比、堿質量分數、浸提溫度、浸提時間。因此，回歸方程擬合度良好，可利用該方程代替真實試驗點進行分析。由P值可知，方程的X3、X4、X2X3、X3X4、X12、X22、X32、X42對Y值影響極顯著（P＜0.01），X1X4對Y值影響顯著（P＜0.05），而X1、X2、X1X2、X1X3、X2X4對Y值無顯著影響（P＞0.05），表明交互作用對響應值影響較小，方程二次項對響應值影響較大。失擬項P=0.860 5，無顯著性影響，表明數據沒有異常點，不需要分析更高次數的項，模型適當。

由表3的P值可知，各試驗因素對羊棲菜蛋白得率的影響排序為：堿質量分數＞浸提溫度＞浸提時間＞液料比。

響應曲面越陡峭，表明響應值對操作條件的變化越敏感，反之曲面越平緩，響應值對操作條件的變化影響就越小。由圖6可知，堿質量分數與浸提時間/浸提溫度變化時，響應值變化比較明顯，堿質量分數2.0%～3.0%與浸提時間5～6 h/浸提溫度55～65℃時，蛋白質得率相對較高。

2.4 最佳工藝條件的確定及驗證

利用Design Expert統計軟件分析，羊棲菜蛋白最佳提取工藝條件為液料比20.96∶1（mL∶g）、浸提時間4.55 h、堿質量分數2.6%、浸提溫度57.34℃，在此條件下得到羊棲菜蛋白的理論得率為28.91%。考慮到實際操作中的便利性及可行性，將提取工藝參數調整正為液料比21∶1（mL∶g）、浸提時間5 h、堿質量分數2.5%、浸提溫度57℃，進行平行驗證試驗，蛋白平均得率為28.95%，與理論預測值相差不大，表明通過響應面設計建立的數學模型對優化羊棲菜蛋白提取工藝具有實際指導意義。

2.5 羊棲菜蛋白功能特性評價

通過對羊棲菜蛋白樣品的幾個功能性質評價，并與市售的大豆分離蛋白產品功能進行性質比較，結果見表4。由表4可知，羊棲菜蛋白的起泡性優于大豆分離蛋白，而其他性質則均略差于大豆分離蛋白。所以，羊棲菜蛋白產品能在一定程度上替代大豆分離蛋白產品，但整體功能性質不如大豆分離蛋白。

表4 羊棲菜蛋白和大豆分離蛋白的功能特性比較Table 4 Comparison of functional properties ofH.fusiformis protein and soybean protein isolate

3 結論

通過單因素試驗和Box-Behnken中心組合設計以及響應面分析對羊棲菜蛋白質提取工藝進行優化。結果表明：各因素對羊棲菜蛋白質得率的影響次序為：堿質量分數＞浸提溫度＞浸提時間＞液料比。最佳提取工藝參數為液料比21∶1（mL∶g），浸提時間5 h，堿質量分數2.5%，浸提溫度57℃。在此最佳工藝條件下，蛋白得率為28.95%，說明此最佳提取工藝切實可行，可廣泛應用于羊棲菜蛋白的制備。羊棲菜蛋白的起泡性優于大豆分離蛋白，而吸水性、吸油性、乳化能力、乳化穩定性、泡沫穩定性均不如大豆分離蛋白。羊棲菜蛋白質含量豐富，可開發成一種新型的功能性高蛋白食品，或作為食品添加劑廣泛應用于各類食品加工。

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Extraction and functional properties ofHizikia fusiformisprotein

PANG Tingcai1,2,HU Shangying3,FAN Heliang2,HUANG Hai2,LIN Lidan2
(1.Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation,Qinzhou University,Qinzhou 535000,China;2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization of Beibu Gulf Seafood Resources,Qinzhou University,Qinzhou 535000,China;3.School of Mechanical and Marine Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535000,China)

WithHizikia fusiformisas raw material,the effect of extraction process on protein yield was investigated,and the functional properties of H.fusiformisprotein were researched.Four factors(including liquid solid ratio,alkali concentration,extraction temperature and time)were researched bysingle factor experiments.The optimum extraction process conditions ofH.fusiformisprotein were determined byBox-Behnken experiments design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction conditions were liquid solid ratio 21∶1(ml∶g),alkali concentration 2.5%,extraction temperature 57℃and time 5 h.Under the optimum conditions,the protein yield was 28.95%.The foaming ability ofH.fusiformis protein was up to 76.7%,which was higher than that of the soybean protein isolate,while the water absorption,oil absorption,emulsifying ability,emulsifying stability and foaming stability were not as good as that of soybean protein isolate.

Hizikia fusiformis;protein;extraction;functional property;response surface methodology

R282.71

0254-5071（2017）09-0148-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.032

2017-02-25

廣西自然科學基金（2016GXNSFAA380067）；廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室（欽州學院）基金資助（2015ZC02）；廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室（欽州學院）基金資助（2016ZB08）

龐庭才（1985-），男，實驗師，碩士，研究方向為動植物活性成分開發與利用。