副干酪乳桿菌誘導Caco-2細胞凋亡及其發酵乳貯藏品質的研究

胡盼盼，劉新民，喻智強，白 建，陳歷水*

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.中糧營養健康研究院食品研發中心，北京 102209；3.老年營養食品研究北京市工程實驗室，北京 102209）

副干酪乳桿菌誘導Caco-2細胞凋亡及其發酵乳貯藏品質的研究

胡盼盼1，劉新民1，喻智強1，白 建1，陳歷水2，3*

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.中糧營養健康研究院食品研發中心，北京 102209；3.老年營養食品研究北京市工程實驗室，北京 102209）

以新疆馬奶酒中自行分離得到的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）M5L為對象，研究該菌株對結腸癌Caco-2細胞的抑制作用并分析發酵乳貯藏品質變化。結果表明，副干酪乳桿菌M5L可以在一定的鹽濃度、膽鹽濃度及酸性環境中較好的生長。當菌體以100∶1的感染系數作用于Caco-2細胞72 h后抑制率最佳；顯微鏡下觀察活菌處理后的細胞發生明顯的凋亡現象；流式細胞儀檢測到副干酪乳桿菌M5L可以誘導Caco-2細胞內活性氧顯著增加，并將細胞周期阻滯在合成期，且通過增大Caspase-3和Bax基因表達量，降低Bcl-2基因表達量來促進腫瘤細胞的凋亡。其發酵酸乳貯藏5 d時品質較佳，長時間的貯存會導致酸乳品質的劣變。

副干酪乳桿菌；發酵乳；抗腫瘤

結腸癌（colorectal cancer）在近20年來的發病率和死亡率逐漸上升[1]，已成為嚴重威脅人類健康的高發性惡性腫瘤之一。結腸癌發病原因很多，但重要的誘發因素多與飲食有關，目前對于結腸癌的治療以手術方法為主，輔以中醫治療或化療、放療等治療方法，雖有一定的效果，但同時也給患者帶來了嚴重的損害，且治療后復發率較高，存活率較低，從而限制了其廣泛的應用。大量實驗研究以及臨床結果表明，天然活性物質能夠清除自由基，增強機體免疫力，抑制體內脂質過氧化，可以有效地干預許多惡性腫瘤的誘發[2]。

乳酸菌是目前最受關注的益生菌之一[3]，常常被用于酸乳和干酪等乳制品的發酵劑及輔助發酵劑，它不僅在一定程度上可以起到延緩衰老和延長壽命[4]、預防某些疾病、增強體質的保健型作用，還能促進機體微生物菌群和酶的平衡[5]，刺激機體發生特異性和非特異性的免疫機制。用其發酵所得的乳制品也具有很好的保健功能，可改善人體胃腸道功能[6]，使腸道菌群的構成發生有益變化，平衡人體腸道內的菌群比例，形成一道生物屏障，維護人體的健康，除此之外還具有免疫調節作用，增強人體免疫力和抵抗力[7]，從而起到抗腫瘤、預防癌癥作用。本實驗室前期從新疆馬奶酒中篩選得到一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）M5L，該菌株產生的肽聚糖具有良好的生物活性[8-9]，但未對菌體本身的生理特性進行研究。因此，本研究以副干酪乳桿菌M5L為研究對象，測定其對結腸癌Caco-2細胞的抑制活性以及其發酵所得的酸乳在貯藏過程中品質變化，以期為其在乳制品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）M5L：從新疆馬奶酒中篩選，現由哈爾濱工業大學食品科學與工程系保藏。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏4 g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，C6H14N2O72g，吐溫-801mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.04 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，水1 000 mL，pH值自然，121℃滅菌15 min。

1.1.3 化學試劑

結腸癌Caco-2細胞株：中國科學院上海細胞生物學研究所；細胞培養液（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：北京清大天一生物技術有限公司；胎牛血清：青旗（上海）生物技術發展有限公司；青鏈霉素混合液100X、胰酶-乙二胺四乙酸消化液、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液：北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）（分析純）：上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Thermo371型細胞培養箱：美國BD公司；ECLIPSETs2倒置相差顯微鏡：日本尼康株式會社PrimeQ熒光定量基因擴增儀：TaKaRa公司；680iMark酶標儀：美國Bio-Rad公司；TA-XT2質構測試儀：西安博宇電氣有限公司；KV-T1分光光度計：南京肯凡電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐鹽性的測定

預先將含量為0、2%、4%、6%、8%、10%的NaCl加入MRS培養基內，每管10 mL，滅菌待用。無菌條件下，將活化后的L.paracaseiM5L以3%的接種量分別接種到試管內，然后放在37℃培養箱內培養，每隔2 h取出，在波長600 nm處進行吸光度值測定[10]。

1.3.2 耐酸性的測定

預先將MRS培養基的pH分別調整至2、4、6、8、10，然后每管10 mL加入試管，滅菌待用。無菌條件下，將活化后的L.paracaseiM5L以3%的接種量分別接種到試管內，然后放在37℃培養箱內培養，每隔2 h取出，在波長600 nm處進行吸光度值測定[10]。

1.3.3 耐膽鹽的測定

預先將含量為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的膽酸鈉加入MRS培養基內，每管10 mL，滅菌待用。無菌條件下，將活化后的L.paracaseiM5L以3%的接種量分別接種到試管內，然后放在37℃培養箱內培養，每隔2 h取出，在波長600 nm處進行吸光度值測定。

1.3.4 L.paracaseiM5L抗腫瘤活性的測定

（1）MTT法：調整細胞濃度為106個/mL，加入96孔板，每孔100 μL。將活菌體在DMEM完全培養液（不含雙抗）中稀釋，加入96孔板中。菌體與癌細胞的最終比例分別為1∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1，檢測活菌對Caco-2細胞增殖的抑制作用，每個濃度5個平行。5%CO2、37℃條件下分別培養24 h、48 h、72 h后吸出培養液，每孔加入150 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次，然后培養板每孔中加入0.5 mg/mL的MTT 100 μL，繼續37℃培養4 h，然后將MTT小心吸出，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于搖床振蕩10 min，以溶解沉淀。用酶標儀在波長490 nm處測定吸光度值，計算腫瘤細胞抑制率。

（2）倒置顯微鏡觀察細胞形態：胰酶消化細胞，調整Caco-2細胞濃度為1×106個/mL，每孔2 mL加入6孔板，培養一天待細胞貼壁后，吸走培養液，分別加入2 mL新鮮的培養基，將100∶1感染系數的L.paracaseiM5L加入6孔板中，對照組中不加，5%CO2、37℃培養72 h，倒置顯微鏡（×400）下觀察細胞數量和形態變化。

（3）細胞周期的測定：將細胞以1×106接種于6孔培養板中培養，每孔2 mL。待細胞長滿后，換含有乳酸菌的不含雙抗的培養液加入菌體使感染系數為100∶1，繼續培養；培養72 h時棄去培養液，用不含EDTA的胰酶加入消化，待細胞脫落后，加培養液終止消化，加入1.5 mL離心管中離心（1 000 r/min、5 min）；同時將廢棄液離心，然后將剩余細胞與貼壁細胞混合；用4℃預冷PBS離心沖洗兩次（1000r/min、5 min）；加入事先-20℃預冷的體積分數70%的乙醇1 mL，放于4℃過夜固定；1 000 r/min離心5 min去除固定液，加入PBS洗兩次（1 000 r/min、5 min）；加入0.5 mL的PI染液（含100 μg/mL RnaseA，100 μg/mL 0.2%Triton X-100），避光30 min上樣到流式細胞儀檢測。

（4）活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定：按照1∶1000比例用無血清培養基稀釋DCFH-DA染液，使其終濃度為5mmol/L。將對照組和100∶1感染系數的乳酸菌處理72h后的細胞培養液移棄，分別加入1mL稀釋好的DCFH-DA染液充分遮蓋住所有細胞。放置到37℃細胞孵箱內，黑暗環境孵育30min后，PBS洗滌2次，以除去未進入細胞內的DCFH-DA探針。胰酶消化并收集各組的Caco-2細胞，PBS清洗2次，迅速放置到流式細胞儀進行熒光信號檢測（激發波長488nm，發射波長525 nm），最終DCF熒光的值大小來反映細胞內ROS量的多少。

（5）RT-PCR：用L.paracaseiM5L孵育Caco-2細胞72 h后，采用Trizol法提取Caco-2細胞的總RNA，之后參照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA。再以cDNA為模板，進行擴增反應，反應條件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min，95 ℃、16 s，60℃、55 s，共進行40循環，同時采用Real-time PCR檢測bcl-2、bax、Caspase-3mRNA的表達水平，結果以β-actin為內參，bax/β-actin、bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin密度比值顯示，并將反應后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，最后拍照并記錄數據。

1.3.5 L.paracaseiM5L發酵乳貯藏品質的測定

（1）酸度和pH變化：全脂復原乳（蔗糖6.5%、全脂粉11.5%）預熱至60℃，均質后在95℃條件下殺菌5 min，冷卻至42℃備用。將活化好的副干酪乳桿菌M5L發酵液（109CFU/mL）按5%接種量接種于已經滅菌好的全脂復原乳中，于42℃培養至pH值為4.5時結束，便制備好發酵乳，最后迅速置于冰水中冷卻至4℃，放置于4℃冰箱，每隔一段時間取出測試pH和酸度。

（2）發酵乳貯藏條件下持水力的變化：發酵乳樣品的持水力采用離心法進行測定。定期稱取發酵乳凝膠樣品約10 g，4 000×g離心30 min，傾去上清物吸干水分后立即稱質量，每個樣品做3個平行試樣，結果取算術平均值。

（3）發酵乳貯藏條件下活菌數變化：將發酵乳放入4℃冰箱冷藏，分別在0 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d后取出，采用MRS固體培養基測定4℃貯藏過程中乳酸菌數量的變化。將樣品以10倍系列稀釋，取1 mL為10-8稀釋液于培養基中，涂板后置于37℃培養一段時間后計數。

（4）發酵乳表觀硬度的測定：定期稱取15.0 g發酵乳樣品，將發酵乳調溫至20～22℃，采用TA-XT2質構測試儀SMS P/25平底柱形探頭（直徑2.5 cm、高4 cm）進行測定。測定條件為：測前速率5.0 mm/s、測試速率2.0 mm/s、測后速率2.0mm/s，探頭進入距離20mm，兩次壓縮之間停留時間5 s。利用質構數據分析軟件由全質構曲線計算得到硬度值。

1.3.6 數據分析

本論文的所有實驗均重復3次，實驗結果以平均值±標準差表示，采用Origin 8.0，SPSS 19.0軟件對實驗數據進行作圖和分析，“*”代表差異顯著（P＜0.05），“**”代表差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 L.paracaseiM5L的生長特性

副干酪乳桿菌在不同鹽含量、pH條件、膽鹽含量條件下的生長情況見圖1。

由圖1可知，鹽濃度能夠影響菌體的生長，添加2%的NaCl溶液時，和原液生長狀況相差不大，隨著NaCl含量的增大，菌體的生長受到抑制，達到穩定期所用時間延長，當NaCl含量達到10%時，菌株幾乎不生長。乳酸菌發揮其生理作用很大程度上取決于菌株是否能順利通過胃的酸性環境以及耐受十二指腸的高膽鹽環境，并以活菌的狀態到達小腸，從而發揮微生態的調整功能[11]。由圖2可知，pH=6的時候，和原液中菌體生長狀況相似。酸性或堿性過強均可一定程度影響到菌體的生長情況，pH=2時菌體生長完全受到抑制。但pH=4時，菌體生長狀況良好，說明具有一定的耐酸性。由圖1可知，添加0.2%的膽酸鈉與在原液中生長狀況相似，隨著膽酸鈉含量的增加，菌體的生長狀況受到一定程度的抑制。

圖1 L.paracaseiM5L在不同鹽濃度（A）、pH（B）膽鹽濃度（C）條件下的生長狀況Fig.1 Growth condition ofL.paracaseiM5L in different NaCl concentration(A),pH(B)and bile salt concentration(C)

2.2 L.paracaseiM5L抗腫瘤活性的測定

2.2.1 MTT實驗結果

將副干酪乳桿菌活菌體按照1∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1的感染系數作用于結腸癌Caco-2細胞，分別作用24 h、48 h、72h，然后MTT法檢測腫瘤細胞的增殖抑制率，結果見圖2。

由圖2可知，抑制率呈現出時間和感染系數依賴性，時間越長，感染系數越大，對Caco-2細胞的抑制效果越好。活菌體作用于癌細胞24 h后，癌細胞抑制率較低，各感染系數組間抑制率沒有明顯差異，作用48 h后抑制率有一定的增大，但總體來說作用于癌細胞24 h和48 h后，其增殖抑制作用不顯著。當活菌體作用于癌細胞72h后，抑制率隨感染系數增大而呈上升趨勢，且抑制率效果最佳，與對照細胞相比，低感染系數的菌體對癌細胞的增殖抑制作用不明顯，當感染系數達到100∶1時，菌體對癌細胞的抑制率最大，因此選為感染系數100∶1作用72 h用于后續的研究。

圖2 MTT實驗結果Fig.2 Results of MTT experiments

2.2.2 倒置顯微鏡結果

凋亡是指細胞在遵循自身程序，在一定生理和病理條件下由基因調控的主動性死亡過程，在此過程中，一般都會出現細胞形態的變化[12]。由圖3可知，未經乳酸菌處理組的細胞生長旺盛，細胞形態正常，生長速度極快，細胞數量呈倍數增長，而經過100∶1感染系數副干酪乳桿菌處理72 h后細胞數量明顯減少，細胞形態破碎，細胞皺縮變圓，細胞體積變小，細胞脫落甚至出現凋亡小體，這說明L.paracasei M5L能夠明顯抑制Caco-2細胞的生長。

圖3 L.paracaseiM5L對Caco-2細胞形態的影響Fig.3 Effect ofL.paracaseiM5L on morphology of Caco-2 cell

2.2.3 細胞周期

細胞周期指連續分裂的細胞從上一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的整個過程，包含G1期、S期、G2期、M期四個階段[13]。本試驗將副干酪乳桿菌L.paracasei M5L活菌體按照100∶1的感染系數作用于結腸癌細胞Caco-2細胞72 h，由圖4可知，活菌處理72 h后，G1期細胞數量顯著減少（P＜0.05），G2期細胞數量無顯著變化，而S期細胞數量顯著增加（P＜0.05），說明L.paracaseiM5L導致Caco-2細胞發生了周期阻滯，主要阻滯在S期，即合成期。同時，由流式細胞儀結果表示乳桿菌處理72 h后，Caco-2細胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），達到（27.73±0.15）%。由此可知，L.paracaseiM5L可通過阻滯合成期來誘導Caco-2細胞凋亡。

圖4 L.paracaseiM5L對Caco-2細胞比例的影響Fig.4 Effect ofL.paracaseiM5L on Caco-2 cell proportion

2.2.4 ROS的測定

活性氧（ROS）主要產生于細胞內線粒體，是生物體內正常細胞代謝過程中的衍生物，但過量的ROS可通過氧化與過氧化作用達到破壞細胞內的DNA、蛋白質以及脂類的效果[14]，從而使線粒體膜受到損傷，引起線粒體功能的障礙，從而導致Caspase激活和凋亡，因此ROS的增加能從一定程度反映細胞凋亡的情況。如圖5所示，經過100∶1感染系數的L.paracaseiM5L活菌處理72 h后，Caco-2細胞內的ROS熒光量顯著增加（P＜0.01），由此表明活菌處理可以誘導細胞內氧化系統的失衡，最終導致細胞損傷。

圖5 L.paracaseiM5L對Caco-2細胞內ROS的影響Fig.5 Effect ofL.paracaseiM5L on intracellular ROS of Caco-2 cell

2.2.5 RT-PCR結果

Caspase家族和Bcl-2家族蛋白是衡量細胞凋亡的重要家族蛋白[15]，本實驗對Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表達量變化進行分析，結果見圖6。

由圖6可知，與未經M5L活菌處理的對照組相比，處理組可以顯著的提高Caco-2細胞中Caspase-3的表達量（P＜0.05），同樣，Caco-2細胞中促凋亡基因Bax表達量也顯著增長（P＜0.05），而抑凋亡基因Bcl-2表達量極顯著降低（P＜0.01），因此Bax/Bcl-2比值變小，腫瘤細胞朝著凋亡的方向進行，由此闡明副干酪乳桿菌M5L可通過影響凋亡相關蛋白的表達來促進Caco-2細胞凋亡的。

2.3 L.paracaseiM5L發酵乳貯藏品質的變化

酸乳是活菌制品，產品貯藏過程中，菌體依然進行生長繁殖，由結果所知，貯藏0～5 d，菌體數量呈現顯著的增長趨勢，第5天后菌落數逐漸減少，這可能是因為貯藏后期，營養物質的消耗以及外界環境的影響導致菌體數量下降。酸度和pH是影響發酵奶最終口感的重要因素，良好風味的發酵乳pH一般為4.5左右，酸度在80～120°T[16]。由表1可知，隨著時間的延長，pH顯著下降，pH由4.54±0.01降低至4.03±0.01，同時酸度逐漸增強，酸度在前5天增長幅度不大，由原來的（75.13±1.33）°T增長至（97.41±2.77）°T，之后緩慢增大。持水力是衡量發酵奶品質的重要指標，發酵乳貯藏前5天內持水力顯著增大，在第5天時由原來的（19.3±0.24）%增大至（22.3±0.22）%，之后逐漸下降，這說明貯藏時間過長，能夠明顯的影響到發酵乳的品質。硬度和黏度也是衡量發酵奶的重要指標[17]。由結果可知，發酵乳在貯藏1d后，硬度和黏度顯著增大，第5天達到最高，之后呈現下降的趨勢，硬度在第13天的時候變為（90.513±2.84）g，這說明短時間的貯藏后熟過程，有利于酸奶品質，隨著時間的延長，硬度值和黏度逐漸下降，這可能是由于發酵后期，菌體生長受到影響，營養消耗，乳清析出，品質也逐漸降低。

圖6 L.paracaseiM5L對凋亡相關基因的表達的影響Fig.6 Effect ofL.paracaseiM5L on apoptosis gene express of Caco-2 cell

表1 發酵乳貯藏過程中品質變化Table 1 Quality changes of fermented milk during storage

3 結論

本實驗選擇從新疆馬奶酒中自行分離得到的副干酪乳桿菌M5L，初步分析它的生長特性，并對副干酪乳桿菌M5L誘導結腸癌Caco-2細胞凋亡進行研究，最后探討其發酵乳在貯藏過程中持水力、菌落數、pH、酸度、硬度等各個指標的變化。副干酪乳桿菌M5L可以在一定的鹽濃度、膽鹽濃度以及酸性環境下較好的生長，這將有利于其在發酵工業中更好的利用。根據MTT結果可知，當活菌體以感染系數100∶1作用于Caco-2細胞72 h后，抑制作用最大，由此用于后續實驗研究。根據倒置顯微鏡結果可知，活菌處理后的癌細胞發生明顯的凋亡現象。通過流式細胞儀測定結果表明活菌處理極其顯著的增加細胞內ROS的含量，并對細胞周期進行測定，處理72 h后，可有效的通過阻滯細胞合成期來抑制細胞生長，凋亡率可達到（27.73±0.15）%。根據反轉錄酶-聚合酶鏈反應（reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR）結果顯示，基因Caspase-3和Bax相對表達值高于對照組，基因Bcl-2表達量低于對照組，由此進一步闡明了副干酪乳桿菌M5L誘導Caco-2細胞凋亡的機制。由副干酪乳桿菌M5L發酵所得發酵乳貯藏過程中持水力、菌落數、硬度和黏度等指標都呈現出先增加后逐漸減小的趨勢，第5天時數值最大，pH和酸度也在貯藏前5 d變化不大，由此可知酸乳貯藏5天時品質最佳。由此設想將副干酪乳桿菌M5L作為乳制品的發酵劑及輔助或酵劑應用于發酵行業，可以有效的增強酸乳的營養功能，同時擴大乳酸菌在抗腫瘤領域的廣泛應用。

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Caco-2 cell apoptosis induced byLactobacillus paracaseiand its fermented milk storage quality

HU Panpan1,LIU Xinmin1,YU Zhiqiang1,BAI Jian1,CHEN Lishui2,3*
(1.Department of Life Science,Lvliang University,Lvliang 033000,China;2.Food R&D Center,COFCO Nutrition and Health Research Institute,Beijing 102209,China;3.Beijing Engineering Laboratory for Geriatric Nutrition Food Research,Beijing 102209,China)

Lactobacillus paracaseiM5L was isolated from Xinjiang Kumiss,its inhibition effect on colorectal cancer Caco-2 cell was studied and the qualitychangeoffermentedmilk wasanalyzed.Resultsshowed thatL.paracaseigrewwellatcertain saltcontent,bile saltcontentand acid environment.The inhibition rate on Caco-2 cells was the optimal byL.paracaseitreatment with infection factor 100∶1 for 72 h,the cells treated withL.paracasei showed obvious apoptosis phenomenon.Flow cytometry detection results showed thatL.paracaseiM5L could induce Caco-2 cells active oxygen content,arrest cell cycle in Synthesis phase,and the cancer cell apoptosis could be accelerated by increasingCaspase-3andBaxgene express or decreasing Bcl-2gene express.The quality of fermented milk was the optimal with storage time 5 d,and longtime storage can lead to yogurt deterioration.

Lactobacillus paracasei;fermented milk;antitumor

TS201.3

0254-5071（2017）09-0142-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.031

2017-06-20

北京市科技計劃（Z161100000616010）；呂梁學院校內基金項目（ZRXN201509）

胡盼盼（1989-），男，助教，碩士，研究方向為乳品科學。

*通訊作者：陳歷水（1974-），男，高級工程師，博士，研究方向為功能性食品。