清香型大曲釀酒酵母株系分類及其可揮發代謝產物分析

周 森，李艷敏，胡佳音，趙衛鵬，聞澤喜，竇 驍，魏金旺*

（1.北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301；2.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000）

清香型大曲釀酒酵母株系分類及其可揮發代謝產物分析

周 森1，李艷敏1，胡佳音1，趙衛鵬1，聞澤喜1，竇 驍2，魏金旺1*

（1.北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301；2.四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000）

為解析牛欄山清香型大曲釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的遺傳多樣性和株系分類，研究了清香型大曲釀酒酵母的菌株分型，并對不同株系釀酒酵母進行了代謝產物分析。利用傳統分離方法及聚合酶鏈反應（PCR）鑒定技術從牛欄山清香型大曲中分離釀酒酵母，對釀酒酵母IGS1區VR1/VR2片段進行單鏈構象多態性（SSCP）基因多態性分析和菌株分型，確定釀酒酵母種下的不同株系，并利用固態發酵實驗分析不同株系釀酒酵母的可揮發代謝產物。結果表明，牛欄山清香大曲釀酒酵母可分為5個株系，其中一個數量較為優勢，在模擬發酵中，5種釀酒酵母發酵產物主要為酸、醇、酯3大類共28種風味物質，其風味種類差異較小，但在乙酸、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、苯乙醇和壬酸乙酯生成量之間存在較大差異。

釀酒酵母；IGS1區；聚合酶鏈反應單鏈構象多態性；代謝產物

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細胞真菌，屬于子囊菌門酵母綱酵母目酵母科酵母屬，在自然界中分布甚廣，是與人類關系最密切的酵母菌之一[1]。釀酒酵母中含有蛋白質、氨基酸、維生素、可食纖維以及微量元素等多種生理活性物質和營養成分，具有營養、保健和醫療等功能[2]。此外，釀酒酵母還是酒精飲料釀造的主要菌種，被廣泛用于啤酒、葡萄酒及白酒等發酵行業，是發酵工業的一種重要微生物。在清香型白酒中，釀酒酵母是大曲眾多微生物中的一種，在隨大曲進入酒醅參與發酵后，能夠通過糖酵解途徑，將發酵環境中的糖類分解為二氧化碳和酒精[3]，是發酵過程中主要的產酒類微生物。在生成酒精的同時，釀酒酵母還能夠生成多種有機酸、高級醇及酯類物質[4]，這些物質在基酒的風味中發揮重要作用。

目前，通過分子技術手段已經可以成熟的對釀酒酵母鑒定到分類學中的“種”的水平[5]，但釀酒酵母在“種”水平之下，依然存在多種類型[6]，這也就形成了雖然同為釀酒酵母，但代謝產物完全不同的現象。如郝欣等[7]對7株釀酒酵母發酵性能和高級醇生成量進行篩選實驗，結果表明，7株釀酒酵母的異丁醇、異戊醇生成量存在明顯差異。蘇寧等[8]對本土優選的3株釀酒酵母同商業菌株進行中試釀酒實驗，結果表明釀酒酵母發酵生成香氣物質種類和含量上都無明顯缺陷，且每個測試菌株都有其各自的特點。

IGS區是酵母核糖體基因的非轉錄區，是酵母核糖體基因變異最大的區域，它被5S rDNA分隔為IGS1和IGS2兩個區域[9]。在釀酒酵母核糖體基因中，IGS1區包含了多個高變區，VR1/VR2片段是IGS1區中包含最大變異區域的一個＜200 bp的片段。

聚合酶鏈反應單鏈構象多態性（polymerase chainreaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）技術是利用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）單鏈構象具有多態性進行基因檢測的一種分析技術，其原理是：PCR擴增獲得的雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA后，在非變劑的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，相同長度的DNA單鏈因其堿基序列不同所形成的空間構象不同，空間構象的不同會引起在電泳中遷移率的改變，會出現泳動變位，通過顯色或顯影后在凝膠上就會顯示出帶型的差別，現已被廣泛應用于各種基因多態性的研究中[10-11]。

目前，已有研究證明利用PCR-SSCP對釀酒酵母IGS1區進行基因多態性分析，可用于釀酒酵母的“種”下分型，如王士安[12]利用VR1/VR2片段對商業釀酒酵母進行分型，結果表明IGS1高變區域的VR1/VR2片段可用于釀酒酵母分型；韓培杰[13]利用VR1/VR2片段完成了傳統面引子中釀酒酵母的分型研究。陳倩[14]以酵面中分離的釀酒酵母為研究對象，對其核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）基因間隔區IGS1中的高變區進行SSCP分析，結果表明民間酵面釀酒酵母菌具有很高的遺傳多樣性。

本研究以牛欄山清香大曲釀酒酵母為研究對象，對其IGS1區VR1/VR2片段進行SSCP基因多態性分析，進行“種”下分型，確定大曲中優勢釀酒酵母，并對釀酒酵母進行風味測定，為篩選優良釀酒酵母奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大曲：牛欄山酒廠清香型大曲。

1.1.2 試劑

三氯甲烷、異丙醇、氯仿、醋酸鉀（均為分析純）：北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、0.5%十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）：上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 培養基

分離培養基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，瓊脂4%，鹽酸調節pH至3.0，煮沸15 min冷卻后傾倒平板。倒平板前加入20 mg/L氯霉素，體積分數為5%乙醇，115℃滅菌20 min。

液體培養基采用YEPD液體培養基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，115℃滅菌30 min，接菌前加入20 mg/L氯霉素。

固體發酵培養基：高粱粉碎后按高粱∶水=1∶4的比例混勻，煮沸后紗布過濾去除液體，固體中加入液化酶，90℃保溫1 h，隨后冷卻60℃加入糖化酶，保溫糖化2 h，攪拌均勻后，稱取40 g于250 mL磨口三角瓶中，115℃滅菌40 min。

1.2 儀器與設備

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；C1000快速梯度基因擴增儀、Powerpac Basic基礎電泳儀、GelDoc XR+BIO-RAD全自動凝膠成像系統、DCodeTM突變檢測電泳儀：美國BIO-RAD公司；1-14k高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；7890B氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲釀酒酵母分離

稱取大曲樣品10g（需要無菌操作）于90 mL無菌水中，擬定為10-1濃度，混勻后吸取1 mL液體接入9 mL無菌水中，標記為10-2，依次稀釋為10-3、10-4、10-5、稀釋濃度，分別吸取10-3、10-4、10-5稀釋液0.1 mL，每個梯度分別涂布于分離培養基中。28℃培養3 d，隨機挑取酵母菌進行平板純化，純化后單獨保存[15]。

1.3.2 釀酒酵母的鑒定

挑取少量活化的酵母菌體，于滅過菌的1.5 mL離心管內；加入100 μL裂解液（100 mmol/L Tris，30 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS），pH 8.0，0.1 MPa滅菌30 min備用；100 ℃水浴15 min；加入100 μL 2.5mol/L的醋酸鉀溶液，冰浴60min；4℃條件下13000r/min離心5min，取上清液200μL至0.5mL離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振蕩10 min，13 000 r/min離心15 min，移取100 μL上清液至0.5 mL離心管中；加入100 μL預冷的異丙醇，混勻后-20℃條件下放置20min；13000r/min離心15 min，棄去上清；用體積分數為70%的酒精洗滌沉淀兩次；沉淀過夜自然干燥；加入50 μL已滅菌的超純水，室溫條件下溶解1 h，-20℃冰箱儲藏備用。

PCR擴增酵母菌D1/D2區，所用引物及PCR條件如下：

NL1：5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG；NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG；PCR反應條件：94℃、3min；（94℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、45 s）35個循環；72 ℃、5 min，冷卻至4℃。

PCR產物送公司測序后，用Chromas軟件分析測序質量，去除峰圖不可靠的部分對DNA序列進行手動校正，用校正后的序列在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行同源序列搜索，比較該菌株在D1/D2序列上親緣關系最近的已知酵母菌信息，包括模式菌株與實驗菌株的堿基差異，近緣模式菌株GenBank序列號，可以根據序列同源性初步判斷待測菌株的分類地位。

1.3.3 釀酒酵母核型分析

擴增20株釀酒酵母的IGS1區，引物及反應條件如下：

VR1-1：5'ATAGTGTGTAAGAGTGTACCATTT 3'；VR1-2：5'TCCATGAAGCAAACTGTCC3'；PCR反應條件：95 ℃、5 min；（94 ℃、45 s，52 ℃、45 s，72 ℃、20 s）循環30次；72℃、8 min，冷卻至4℃。

PCR結束后對PCR產物進行單鏈樣品制備，取5 μL（大約150～300 ng）與等量的上樣緩沖液（0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯青，95%甲酰胺，4%0.5 mol/L EDTA，pH8.0）混勻，在95℃變性5～10 min，迅速放在冰上，放置15 min。

SSCP電泳檢測及染色參照文獻[12]中的方法。

1.3.4 釀酒酵母風味測定

樣品前處理：將釀酒酵母接入250 mL液體培養基中，30℃、150 r/min培養3 d，吸取4 mL發酵液加入固體培養基中，插入發酵栓后用5 mL2.61 mol/L硫酸封口，30℃培養箱靜置培養7 d后，拔去發酵栓，加入40 mL色譜純無水乙醇，超聲萃取40min后，吸取上清5mL，12000r/min離心20min，0.4 μm濾膜過濾后進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：進樣口溫度250℃、進樣量0.5 μL、分流比30∶1、柱箱升溫程序為35℃（1 min），2℃/min升至100℃，3℃/min升至230℃（10min）、CPwax58色譜柱（50m×0.2 mm×0.2 μm）、檢測器溫度：280℃。

2 結果與分析

2.1 大曲釀酒酵母分離及鑒定

圖1 大曲中酵母的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of isolated yeasts from Daqu

大曲稀釋涂布后，根據釀酒酵母形態特征，隨機挑選形態呈圓形、乳白色、菌落平坦稍凸起生長、有濕潤感、光滑、邊緣整齊的單菌落進行純化，共計挑選出疑似釀酒酵母菌株30株編號為JM-1～JM-30。PCR鑒定及比對后，用MEGA5.0軟件構建系統發育樹，進行聚類分析，得到酵母菌系統發育樹結果如圖1所示，在所分離的30株酵母中，含有異常漢遜酵母（Hansenula anomala）6株，扁平云假絲酵母（Candida humilis）4株，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）20株。

2.2 釀酒酵母核型分析

對鑒定后的20株釀酒酵母進行編號整理，標記為1#～20#，PCR擴增上述釀酒酵母的VR1-1和VR1-2片段，PCR產物進行SSCP電泳分析。

圖2 20株釀酒酵母SSCP電泳分析圖Fig.2 SSCP profile of 20 strainsSaccharomyces cerevisiae

由圖2可知，20株大曲釀酒酵母經過SSCP電泳分析后，可以將大曲中釀酒酵母分為5大類。分別為1#、2#、3#、4#～16#和17#～20#。其中4#～16#是大曲中數量較多的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在所分析的20株釀酒酵母中共有13株屬于此類。17#～20#其次，共有4株釀酒酵母屬于此類。1#、2#和3#最少，只有一株。

2.3 釀酒酵母風味測定結果

根據釀酒酵母分型結果，從5種類型中各挑選一株釀酒酵母進行模擬固體發酵及風味測定，挑選菌種為1#、2#、3#、7#和18#。將5株釀酒酵母固態發酵產物及空白培養基（對照樣品）進行酒精超聲萃取，萃取液離心過濾后進行風味分析，結果見表1。

由表1所示，釀酒酵母發酵產物主要為酸、醇、酯3大類共28種風味物質[16]，其中酸類11種，醇類6種，酯類11種。

酸類物質是牛欄山二鍋頭酒香氣的主要協調成分，適量的酸有助于酒體的放香舒適性[17]。釀酒酵母代謝產生中共生成11種有機酸，同對照相比，增長較多的有機酸主要為乙酸、異戊酸、2-甲基丙酸、庚酸和辛酸。其中，1#酵母是生成乙酸最多的釀酒酵母，達到了824.02 mg/L，同對照相比增長了123%，而其余釀酒酵母乙酸含量均出現了降低；7#酵母生成異戊酸含量為171.75mg/L，是異戊醇增長量最高的釀酒酵母；除18#酵母外，其余酵母都表現出較高的生成2-甲基丙酸的能力，生成量分別達到了114.78 mg/L、159.24 mg/L、154.84mg/L和141.44mg/L，遠遠高于對照樣品的14.12mg/L；5種釀酒酵母均具有合成庚酸的能力，同對照相比，分別提高了38%、74%、63.4%、70.7%、64.65%；18#具有較強的合成辛酸的能力含量可達到46.85 mg/L。而其余十六酸、癸酸、壬酸、丙酸、十二酸、己酸這幾類酸類雖然在釀酒酵母代謝產物中能夠檢測到，但其含量低于空白對照組，故不認為其具有高產這幾類有機酸的能力。

表1 釀酒酵母模擬發酵試驗風味物質檢測結果Table 1 Flavor compounds detection results of the simulated fermentation experiments ofS.cerevisiae mg/L

醇類物質是牛欄山二鍋頭酒體香氣的重要成分，其能夠賦予酒體醇香、水果香。釀酒酵母產物中共檢測出6種醇類，其中3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇和正丙醇是生成量較多的醇類物質，而甲醇和壬醇只在3#和18#釀酒酵母中出現，且含量僅為3.83 mg/L和0.86 mg/L；在含量較多的4種醇類風味中，正丙醇生成量差異較小，5種釀酒酵母正丙醇生成量在19.42～23.60 mg/L之間；同時，5種釀酒酵母在合成3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇上呈現一定規律性，1#是這幾種醇類生成量最少的釀酒酵母，這3種醇類生成量分別為55.54 mg/L、18.81 mg/L和12.49 mg/L，其次是18#，而2#、3#和7#這3種醇類生成量相對較高，且數值較為接近，如3-甲基丁醇生成量在104.25～110.57 mg/L，苯乙醇含量在57.88～60.63 mg/L，2-甲基丙醇含量在45.89～47.69 mg/L，其含量遠高于1#和18#。

酯類物質是牛欄山二鍋頭的重要呈香成分，大部分表現為水果香、花香[18]。釀酒酵母產物中共檢測出11種酯類物質，同對照相比，壬酸乙酯是生成量最高的酯類物質，5種釀酒酵母生成壬酸乙酯含量分別為172.64 mg/L、69.42 mg/L、74.77 mg/L、70.57 mg/L和50.73 mg/L，遠高于對照樣品的5.47 mg/L；亞油酸乙酯同樣屬于增長量較高的酯類物質且5種釀酒酵母生成量較為接近，其含量由對照組的1.23mg/L增長至30.05～36.32 mg/L；油酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸異戊酯和丁二酸二乙酯這5種酯類雖然出現增長，但含量較低，如油酸乙酯最高含量僅為3#的13.92 mg/L，十六酸乙酯最高為7#的9.75mg/L。而乙酸苯乙酯、乳酸異戊酯、十七酸乙酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯這5種酯類同對照相比生成量較少或只有個別酵母產生，故不進行討論。

3 結論

從牛欄山清香型大曲中共分離鑒定20株釀酒酵母，利用PCR-SSCP技術對釀酒酵母IGS1區進行“種”下分型，將大曲中釀酒酵母分為5大類型，其中一種類型在數量上較為優勢。通過對釀酒酵母風味分析可以看出，釀酒酵母除可產生酒精外，還具有生成酸類、醇類和酯類化合物的能力。本次實驗中共檢測到酸、醇、酯三大類共計28種化合物，其中酸類中的乙酸、2-甲基丙酸，醇類中的3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇，酯類中的壬酸乙酯和亞油酸乙酯是生成量增長較多的化合物。通過對不同類型釀酒酵母風味比較可以看出，不同類型釀酒酵母生成的風味物質種類較為一致，但生成量之間存在一定差距，如1#具有較強的產乙酸和壬酸乙酯的能力，其含量分別為824.02 mg/L和172.64 mg/L；18#產2-甲基丙酸能力較弱，僅為37.21 mg/L；2#、3#和7#生成3-甲基丁醇量在104.25～110.57 mg/L，遠高于1#和18#的55.54 mg/L和66.70 mg/L。

綜上所示，本研究利用PCR-SSCP技術結合IGS1區片段對牛欄山大曲中釀酒酵母進行“種”下分型并進行模擬發酵風味測定。較為系統的對大曲中釀酒酵母進行分類，確定了大曲中釀酒酵母的“種”下組成，并根據釀酒酵母的風味分析結果，獲得了不同釀酒酵母代謝風味的差異。將2種技術手段相結合可以有助于更為簡便、有效地篩選產香能力優秀的釀酒酵母，為下一步釀酒酵母強化添加，提高基酒風味打基礎。

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Strain classification and volatile metabolites analysis ofSaccharomyces cerevisiaefrom light-flavor Daqu

ZHOU Sen1,LI Yanmin1,HU Jiayin1,ZHAO Weipeng1,WEN Zexi1,DOU Xiao2,WEI Jinwang1*
(1.Beijing Shun Xin Agriculture Co.,Ltd.,Niulanshan Distillery,Beijing 101301,China;2.School of Bioengineering,Sichuan University of Science＆Engineering,Zigong 643000,China)

In order to analyze genetic diversity and strain classification ofSaccharomyces cerevisiaefrom Niulanshan light-flavor Daqu,the strain types and metabolite ofS.cerevisiaewere researched.By traditional separation methods and polymerase chain reaction(PCR)identification technique,S.cerevisiaewas separated from Niulanshan light-flavor Daqu,the gene polymorphism of single strand conformation polymorphism ofS.cerevisiae IGS1 region VR1/VR2 fragment was analyzed.The different strains ofS.cerevisiaewere determined and their volatile metabolites were analyzed by solid state fermentation experiments.The results showed that theS.cerevisiaefrom Niulanshan light-flavor Daqu could be divided into 5 strains,one of which was superior.In the simulated fermentation experiments,the fermentation products of 5S.cerevisiaestrains were mainly 28 kinds of flavor compounds in three major categories(such as acids,alcohols and esters).There was no significant difference between the types of flavor components.But the yield of acetic acid,3-methylbutanol,2-methylpropanol,phenylethyl alcohol and ethyl pelargonate had great differences.

Saccharomyces cerevisiae;IGS1 region;PCR-SSCP;metabolite

TS262.3

0254-5071（2017）09-0137-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.030

2017-06-09

周 森（1986-），男，工程師，本科，研究方向為白酒釀造微生物。

*通訊作者：魏金旺（1971-），男，本科，研究方向為白酒釀造微生物。