不同碳源對粘性紅酵母WP3生長及類胡蘿卜素產量的影響

王 蓉，曹海寧，鄧小美

（湖南環境生物職業技術學院醫藥技術學院，湖南 衡陽 421000）

不同碳源對粘性紅酵母WP3生長及類胡蘿卜素產量的影響

王 蓉，曹海寧，鄧小美

（湖南環境生物職業技術學院醫藥技術學院，湖南 衡陽 421000）

研究了不同碳源及含量對粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）WP3生長及類胡蘿卜素積累的影響。結果表明，在所研究的碳源中，葡萄糖有利于生長，而果糖有利于類胡蘿卜素積累。在碳源含量為40 g/L，果糖和葡萄糖比例為7∶1，果糖含量為35 g/L，葡萄糖含量為5 g/L時，粘性紅酵母WP3的生物量為7.94，類胡蘿卜素產量達到556.84 μg/L，對粘性紅酵母生長及類胡蘿卜素合成有利。

碳源；粘性紅酵母；生物量；類胡蘿卜素；產量

類胡蘿卜素是自然界分布廣泛的天然色素，存在于微生物中，也存在于一些植物和動物資源中，已發現的類胡蘿卜素種類多于600多種[1]。動物不能合成類胡蘿卜素，類胡蘿卜素主要的生物功能是抗癌和作為維生素前體[2]。一些微生物，包括細菌、藻類、霉菌和酵母都能夠合成類胡蘿卜素[3]。酵母比藻類、霉菌更適合生產類胡蘿卜素，因為它們的單細胞特性和高生長速率[4]。酵母合成類胡蘿卜素被大量環境和發酵參數影響，特別是培養基成分起了重要作用[5]。

一些酵母積累類胡蘿卜素，如β-胡蘿卜素、紅酵母烯和紅酵母紅素，使它們呈黃、橙、紅色，因此稱為紅酵母。紅酵母屬于子囊菌綱半子囊菌亞綱酵母目隱球酵母科紅酵母亞科[6]。能生產類胡蘿卜素的酵母菌主要有粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa），粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）和紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma）[7]。產類胡蘿卜素的酵母被認為無所不在，因為廣泛分布在陸地、淡水和海洋環境中，能夠利用各種底物。它們能夠同化各種碳源（如葡萄糖、木糖、纖維二糖、蔗糖、甘油、山梨醇等）。國內許多學者也相繼研究了紅酵母，但主要研究紅酵母的一些破壁方法、類胡蘿卜素高產菌株的選育，而在紅酵母發酵條件如培養基成分方面研究甚少。

本研究從不同碳源入手，應用單因素試驗研究不同碳源和濃度對粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）WP3生物量和類胡蘿卜素合成的影響，還對混合碳源的比例影響進行了探究。在可控條件下得到粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）WP3類胡蘿卜素發酵的最佳碳源，提高類胡蘿卜素產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）WP3：廣西科技大學化學工程與技術學院實驗室保存[8]。

1.1.2 試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘油（均為分析純）：國藥集團化學試劑公司；類胡蘿卜素標準品（純度＞99%）：上海賽弗生物科技有限公司；所用其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

斜面培養基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

MS3培養基：葡萄糖30g/L，酵母粉1.5g/L，NH4NO35g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，NaCl 0.4 g/L，補足自來水[9]。

MS3-A培養基：酵母粉1.5 g/L，NH4NO35 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，NaCl 0.4 g/L，補足自來水。

1.2 儀器與設備

JJ200電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；DMB5Motic數碼顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；LRH-250-Ⅱ生化培養箱：廣西省醫療器械廠；HWY-2112全溫度恒溫調速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；AB104-N電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；XB-K-25血球計數板：廣西南寧融儀實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的保藏

配制斜面培養基，加熱然后分裝滅菌，擺出斜面，將菌種粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）WP3接入斜面，28℃培養2 d，然后置于4℃冰箱保存，一個月活化一次[10]。

1.3.2 種子的培養

取一環生命力旺盛的斜面種子接于裝有50 mLMS3培養基的150 mL錐形瓶中，30 ℃、150 r/min[11]培養3 d，取此培養液5 mL接于裝有50 mL MS3培養基的150 mL錐形瓶中，30℃、150 r/min再次培養3 d，取發酵液離心得細胞沉淀，細胞重懸于無菌水中，用血球計數板計數，使接種量達到107個/mL。

1.3.3 搖瓶培養

按接種量107個/mL將種子液接入裝有300mL發酵培養液的500 mL錐形瓶中，30℃、150 r/min培養7 d。每次做3組平行實驗[12]。

1.3.4 生物量的測定

取細胞分散均勻的發酵液，離心去上清液，加等體積的水，重懸，用UV-1100紫外可見分光光度計測細胞懸浮液的吸光度值A600nm[13]。

1.3.5 比生長速率的計算

比生長速率指的是在單位時間內單位質量的菌體所增加的菌體量，它是表征微生物生長速率的一個參數，也是發酵動力學中的一個重要參數，其計算公式如下[14]：

式中：μ為連續培養時間內的比生長速率，h-1；N1及N0分別為培養時間為t1和t0時紅酵母細胞的密度，即為生物量A600nm。

1.3.6 類胡蘿卜素的提取

取20 mL培養7 d的發酵液6 000×g離心5 min，得濕菌體，棄上清，水洗沉淀，加4 mL 5 mol/L鹽酸振蕩1 h，沸水浴4 min，離心去除鹽酸，加水重懸，離心棄上清液，沉淀加丙酮混勻，離心收集上清液，重復此步驟直到上清液無色，將幾次所提的丙酮上清液混合為提取液，將其轉移到裝有石油醚（沸程為60～90℃）的分液漏斗中，通過緩慢添加超純水（防止乳化）除去丙酮，再棄水相，這個過程重復4次，直到丙酮相不再含色素得到的提取液為測定液[15]。

1.3.7 類胡蘿卜素產量的測定

石油醚提取液在最大吸收波長450 nm處測定吸光度值[16]，總的類胡蘿卜素含量計算公式如下[15]：

式中：V為定容后總類胡蘿卜素提取液體積，mL；A為波長450 nm處的吸光度值；消光系數A1%1cm表示在最大吸收峰450 nm處的光通過1 cm光徑、盛有1%類胡蘿卜素標準品溶液的比色杯，測得的光密度，為3次所測的平均值；P為提取所用發酵培養液體積，mL。

2 結果與分析

2.1 不同初始pH值對細胞生長和類胡蘿卜素合成的影響

配制MS3培養基，裝液量為300 mL/500 mL，調節初始pH值分別為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種WP3至培養基中至細胞濃度為107個/mL，30 ℃、150 r/min培養7 d[4]，最后取樣測類胡蘿卜素含量和細胞生物量，結果見圖1。

圖1 初始pH值對粘性紅酵母WP3生物量和類胡蘿卜素積累的影響Fig.1 Effect of initial pH on the biomass ofR.mucilaginosaWP3 and the accumulation of carotenoids

由圖1可知，粘性紅酵母WP3能在初始pH值4.0～8.0的范圍內生長并合成類胡蘿卜素，培養基的pH值不僅影響類胡蘿卜素的合成，還影響細胞生長速率[17]。隨著初始pH值在4.0～7.5范圍內的增長，生物量逐漸增長，在pH值為7.5時，生物量達到最大，pH值＞7.5之后，生物量開始下降，而最大的類胡蘿卜素含量也在pH值7.5處獲得，pH值小于或大于7.5，類胡蘿卜素含量明顯下降。因此pH值7.5為最優pH值。本實驗結果和AKSUZ等[17]研究的最優pH值7.0相近。

2.2 培養過程中pH值的變化

配制MS3培養基，裝液量為300 mL/500 mL，調節初始pH值為7.5，接種WP3至培養基中至細胞濃度為107個/mL，30℃、150 r/min培養7 d，每隔24 h測一次pH值，觀察其變化情況，結果見圖2。

圖2 培養過程中pH值的變化Fig.2 Change of pH value in the process of cultivation

由圖2可知，可將紅酵母的發酵分為兩個階段，第一階段是從0～4 d，紅酵母主要利用培養基中的葡萄糖，通過糖酵解和檸檬酸循環途徑進行初級代謝，代謝分泌出有機酸等酸性物質，使培養基pH值下降，因而前4天pH值呈下降趨勢，4 d后培養基中葡萄糖含量不足，于是紅酵母進入過渡期，一方面利用葡萄糖，一方面利用第一階段分泌出的有機酸，有機酸被利用，于是pH值回升，進入發酵的第二階段，隨后進入穩定期，培養基pH值也比較穩定，表現為第6天、第7天pH值變化不大，因而可根據pH值的變化監測發酵程度。

2.3 培養過程中生物量和類胡蘿卜素含量的變化

配制MS3培養基，裝液量為300 mL/500 mL，調節初始pH值為7.5，接種WP3至培養基中至細胞濃度為107個/mL，30℃、150r/min培養7d，每隔24h測一次類胡蘿卜素含量和細胞生物量，觀察其變化情況，結果見圖3。

圖3 培養過程中粘性紅酵母WP3生物量和類胡蘿卜素積累的變化Fig.3 Changes of the biomass ofR.mucilaginosaWP3 and accumulation of carotenoids in the process of cultivation

由圖3可知，紅酵母發酵在第5天后進入穩定期，在最后培養的2d內OD600nm幾乎不增加（僅增加0.21）。類胡蘿卜素是次級代謝產物，基本在細胞生長的穩定期形成，因而類胡蘿卜素在培養時間內一直增加，穩定期時類胡蘿卜素積累加快，7d發酵結束時，類胡蘿卜素含量最大，為471.0007μg/L。由此變化與pH值變化聯系起來可監測發酵階段。

2.4 不同碳源對細胞生長和類胡蘿卜素合成的影響

配制MS3-A培養基，分別加入不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘油）各30 g/L，調節pH值為7.5，裝液量為300 mL/500 mL，接種菌株WP3至培養基中至細胞濃度為107個/mL，30 ℃、150 r/min培養7 d，每間隔24 h取樣測生物量，發酵結束后取樣測類胡蘿卜素含量，結果分別見圖4和圖5。

圖4 不同碳源對粘性紅酵母WP3生物量的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on the biomass of R.mucilaginosaWP3

由圖4可知，在0～3 d，隨著時間的增長，細胞生物量不斷增大，隨后生物量逐漸趨于穩定，細胞生長進入穩定期。加入不同碳源，細胞生物量變化不一致，以麥芽糖和甘油為碳源時細胞生長最差，7 d后生物量最低，分別為6.06和5.92，平均比生長速率只達到0.015 5 h-1和0.015 2 h-1，在實驗濃度30g/L時，甘油不利于紅酵母的生長，這與JOHNSON A等[18]的研究紅酵母對甘油的利用能力較弱結果一致，而利用其他碳源，菌株WP3都有一個好的長勢，同時觀察到在以葡萄糖為碳源的情況下細胞生長最好，7 d后生物量為8.11，平均比生長速率達到0.017 2 h-1，而蔗糖和果糖7 d后的生物量分別為7.90和7.78，平均比生長速率為0.0167h-1和0.016 3 h-1，雖然蔗糖的最大比生長速率達到0.099 0 h-1，大于葡萄糖，但總體上生長還是比葡萄糖差，因此最利于菌株WP3生長的碳源是葡萄糖。

圖5 不同碳源對類胡蘿卜素積累的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the accumulation of carotenoids

由圖5可知，在以果糖為碳源的情況下獲得了最大類胡蘿卜素含量，為496.399 0 μg/L，以蔗糖為碳源產量緊隨其后，為484.986 0 μg/L，而以葡萄糖為碳源時細胞生長最好，因此最佳碳源為果糖，而葡萄糖最利于細胞生長。這個結果和LATHA B V等[19]實驗中得出粘紅酵母DFR-PDY在以果糖為碳源時獲得了最大類胡蘿卜素產量，在以麥芽糖為碳源時類胡蘿卜素產量很低的結論一致。

2.5 碳源條件兩對細胞生長和類胡蘿卜素合成的影響

配制MS3-A培養基，分別加入果糖10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L，調節pH值為7.5，裝液量為300mL/500mL，接種WP3至培養基中至細胞濃度為107個/mL，30℃、150r/min培養7 d，最后取樣測總類胡蘿卜素含量和生物量，結果見圖6。

圖6 果糖含量對粘性紅酵母WP3生物量和類胡蘿卜素積累的影響Fig.6 Effect of fructose concentration on the biomass of R.mucilaginosaWP3 and the accumulation of carotenoids

由圖6可知，果糖含量在10～40 g/L時，類胡蘿卜素含量隨初始果糖含量增加而增加；果糖含量達到40 g/L時，類胡蘿卜素含量和生物量達到最大值，分別為520.6723 μg/L和7.86；果糖含量＞40 g/L時，類胡蘿卜素產量隨果糖含量增加而減少，可能是過高的果糖含量不利于其發酵。因此最佳果糖含量為40 g/L。

2.6 混合碳源對細胞生長和類胡蘿卜素合成的影響

以上述實驗為基礎，葡萄糖為碳源時最利于粘性紅酵母WP3的生長，而果糖為碳源時最利于菌株WP3的類胡蘿卜素的合成，從菌株WP3對碳源的利用情況來看，要提高類胡蘿卜素產量需從兩方面下手，一方面促進細胞生長，另一方面提高類胡蘿卜素含量，因此用果糖，葡萄糖來進行混合發酵。

配制MS3-A培養基，加入果糖∶葡萄糖分別為0∶1、1∶7、1∶3、1∶1、3∶1、7∶1、1∶0混合碳源40 g/L，調節pH值為7.5，裝液量為300 mL/500 mL，接種菌株WP3至培養基中至細胞濃度為107個/mL，30 ℃、150 r/min培養7 d，最后取樣測類胡蘿卜素含量和生物量，結果見圖7。

由圖7可知，當果糖與葡萄糖的比例為7∶1時，即類胡蘿卜素含量達到最大，為556.8413μg/L，高于葡萄糖和果糖單獨作為碳源時的類胡蘿卜素產量（分別為476.144 7 μg/L、520.672 3 μg/L）。結果表明，使用果糖∶葡萄糖為7∶1的混合碳源更好，果糖最利于類胡蘿卜素合成，葡萄糖最利于粘性紅酵母WP3的生長，使用此比例混合碳源產量更高，說明果糖和葡萄糖之間可能存在交互作用。

圖7 不同比例果糖和葡萄糖混合對粘性紅酵母WP3生物量和類胡蘿卜素積累的影響Fig.7 Effects of fructose and glucose ratio on the biomass of R.mucilaginosaWP3 and the accumulation of carotenoids

3 結論

本研究從培養基成分中的不同碳源入手，研究了不同碳源對粘性紅酵母WP3生物量和類胡蘿卜素合成的影響，結果表明，不同碳源對粘性紅酵母WP3細胞生長和類胡蘿卜素合成有顯著影響，確定類胡蘿卜素合成最佳碳源為果糖，最利于細胞生長的碳源為葡萄糖，最佳碳源含量為40 g/L，果糖和葡萄糖最佳混合比例為7∶1，即果糖含量為35 g/L，葡萄糖含量為5 g/L時，粘性紅酵母WP3的生物量為7.94，類胡蘿卜素產量達到最高，為556.841 3 μg/L。

[1]YEHIA H M,AL-OLAYAN E M,ELKHADRAGY M F,et al.Improvement of carotenoid pigments produced byRhodotorula glutinis[M].Epigenetics in Human Disease.Elsevier Inc.2013:28-47.

[2]BANZATTO D,FREITA L A D,MUTTON M J R.Carotenoid production byRhodotorula rubracultivated in sugarcane juice,molasses,and syrup[J].Food Sci Technol,2013,33(Supl.1):14-18.

[3]FRENGOVA G I,BESHKOVA D M.Carotenoids fromRhodotorula andPhaffia:yeasts of biotechnological importance[J].J Ind Microbiol Biotechnoly,2009,36(2):163-180.

[4]VOAIDES C,DIMA R.Effect of carbon source on carotenoid production byRhodotorulasp.[J].Archiva Zootechnica,2011,17(5):7570-7576.

[5]FERRAO M,GARG S.Studies on effect of media components on growth and α-caroteneproduction byRhodotorula graminisRC04[J].J Cell Tissue Res,2011,11(1):2551-2556.

[6]張 闖，張玉蒼，何連芳.不同微生物生產類胡蘿卜素的研究現狀[J].食品研究與開發，2011，32（2）：179-183.

[7]FRENGOVA G I,BESHKOVA D M.Carotenoids fromRhodotorulaand PhaYa:yeastsofbiotechnologicalimportance[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2009,36:163-180.

[8]王 蓉，伍時華，趙東玲，等.一株能產類胡蘿卜素的粘性紅酵母的分離與鑒定[J].中國調味品，2015，40（4）：16-20.

[9]MIHALCEA A,UNGUREANU C,FERDES M,et al.The influence of operating conditionson the growth of the yeastRhodotorula rubraICCF 209 and on torularhodin formation[J].Rev De Chim,2011,62(6):659-665.

[10]朱明軍，浦躍武，吳海珍，等.不同碳源及其濃度對紅發夫酵母培養的影響[J].華南理工大學學報：自然科學版，2002，30（4）：77-80.

[11]倉一華，陸 玲，王 偉，等.一株高產類胡蘿卜素酵母Rhodotorrula.sp 色素組分及搖瓶發酵研究[J].食品科學，2002，23（5）：34-37.

[12]石 群，張慶芳，楊麗娜，等.肌酐水解酶菌株S-09發酵條件優化及酶的分離純化[J].中國釀造，2017，36（4）：20-25.

[13]CATALINA V,DIMA R.The effect of nitrogen source on carotenoids production byRhodotorulasp[J].Roman Biotechnol Lett,2012,17(5):7570-7576.

[14]梁 英，孫明輝，劉春強，等.營養鹽輸入方式對3種微藻生長及種間競爭的影響[J].中國海洋大學學報：自然科學版，2014，44（12）：21-27.

[15]DE CARVALHO L M J,GOMES P B,GODOY R,et al.Total carotenoid content,α-carotene and β-carotene,of landrace pumpkins(Cucurbita moschataDuch):Apreliminarystudy[J].Food Res Int,2012,47(2):337-340.

[16]魏 華，魏 春，汪 釗.Sporidiobolus pararoseusWZ012產類胡蘿卜素發酵條件的優化[J].食品科技，2012，37（8）：22-26.

[17]AKSU Z,EREN A T.Carotenoids production by the yeastRhodotorula mucilaginosa:Use of agricultural wastes as a carbon source[J].Process Biochem,2005,40(9):2985-2991.

[18]JOHNSON E A,HWAN A G.Astaxanthin from microbial sources[J].CRC Crit Rev Biotechnol,1991,4(11):297-326.

[19]LATHA B V,JEEVARATNAM K,MURALI H S,et al.Influence of growth factors on carotenoid pigmentation ofRhodotorula glutinisDFRPDY from natural source[J].Indian J Biotechnol,2005,4(4):353-357.

Effects of different carbon sources onRhodotorula mucilaginosaWP3 growth and carotenoids production

WANG Rong,CAO Haining,DENG Xiaomei
(School of Medicine Technology,Hunan Polytechnic Institute of Environmental Biology,Hengyang 421000,China)

The effects of different carbon sources and contents on the growth ofRhodotorula mucilaginosaWP3 and the accumulation of carotenoids were researched.The results showed that in the carbon sources studied,glucose was the most beneficial to cell growth,while fructose was the most beneficial to the accumulation of carotenoids.In the conditions of carbon sources 40 g/L,fructose and glucose ratio 7∶1(fructose 35 g/L and glucose 5 g/L),the biomass ofR.mucilaginosaWP3 was 7.94 and carotenoids yield was up to 556.84 μg/L,which indicated that the conditions were beneficial to the growth ofR.mucilaginosaand the accumulation of carotenoids.

carbon source;Rhodotorula mucilaginosa;biomass;carotenoids;production

TS219

0254-5071（2017）09-0132-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.029

2017-06-07

王 蓉（1989-），女，助教，碩士，研究方向為化學工程與技術。