新疆阿勒泰地區(qū)酸奶疙瘩中乳酸菌的分離和鑒定

劉俊峰，尹 雪，郭雪峰*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆阿勒泰地區(qū)酸奶疙瘩中乳酸菌的分離和鑒定

劉俊峰1，2，尹 雪1，郭雪峰1，2*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

從新疆阿勒泰地區(qū)牧民制作的傳統(tǒng)酸奶疙瘩中分離、篩選出菌株SA，通過過氧化氫酶試驗(yàn)陰性初步確定其為乳酸菌，對菌株SA進(jìn)行菌落和細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，分離菌株SA與Weissella cibaria KACC 11862 AEKT01000037聚為一類，其同源性為99%，故將其鑒定為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）。其最佳生長條件為40℃、pH 6.0，并且能夠耐受3%的NaCl。

乳酸菌；分離；鑒定

我國新疆地區(qū)水草豐盛，少數(shù)民族牧民們采用傳統(tǒng)古老的方法制作乳制品，生產(chǎn)的方法流程簡單，風(fēng)味很獨(dú)特，含有大量對機(jī)體有益的乳酸菌。研究發(fā)現(xiàn)新疆哈薩克牧民對酸奶的食用可能是預(yù)防食道癌的有效方法之一[1]。本試驗(yàn)中從新疆阿勒泰地區(qū)牧民家庭制作的酸奶疙瘩中分離篩選優(yōu)勢乳酸菌株，為優(yōu)勢乳酸菌功能的開發(fā)利用奠定一定的基礎(chǔ)，同時(shí)也為保護(hù)我國豐富的乳酸菌資源，豐富的發(fā)酵劑種類提供依據(jù)。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在很多領(lǐng)域中有較高的應(yīng)用價(jià)值，它們可以用于工業(yè)乳酸的生產(chǎn)、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵蔬菜、酸面包、青貯材料、微生物飼料添加劑和乳酸菌醫(yī)用制劑等。乳酸菌的分類至少分為23個(gè)屬300多個(gè)種[2]，而乳酸菌一般包括肉食桿菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、漫游球菌屬、乳球菌屬、四聯(lián)球菌屬和魏斯氏菌屬等[3]。對乳酸菌的基礎(chǔ)鑒定主要基于表型和生化特征，按照細(xì)胞形態(tài)來分，可將乳酸菌分為桿菌和球菌，根據(jù)葡萄糖代謝途徑的不同，可以將乳酸菌的發(fā)酵類型分為同型發(fā)酵和異型發(fā)酵[4]。最初區(qū)分乳酸菌不同菌屬的方法都是基于表型特征和生物化學(xué)鑒定。然而隨著不斷涌現(xiàn)的新種屬的描述，利用這些經(jīng)典方法可靠地鑒定到種屬變得越來越困難。隨著科技的進(jìn)步分子生物學(xué)方法能夠?qū)⒕N鑒定到種甚至是亞種，許多新的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用到乳酸菌的分類鑒定[5-7]。彭斌[8]從新疆傳統(tǒng)奶疙瘩中的乳酸菌進(jìn)行了分麗篩選，得到了可用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)的組合菌株，優(yōu)化奶疙瘩發(fā)酵工藝，改善傳統(tǒng)奶疙瘩的質(zhì)量品質(zhì)。凌空等[9]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駱駝奶、馬奶子和辣椒醬中分離篩選得到13株乳酸菌，篩選獲得了3株具有潛在生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌。敖曉玲[10]以川西高原牧區(qū)自然發(fā)酵的酸乳中分離出109株乳酸菌（桿菌59株、球菌50株）作為研究對象，通過初篩、復(fù)篩及組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，確定了生產(chǎn)酸奶的最佳菌種、菌種組合和發(fā)酵條件。

本實(shí)驗(yàn)是從阿勒泰地區(qū)牧民制作的傳統(tǒng)酸奶疙瘩中分離、篩選出優(yōu)良的乳酸菌菌株，進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)合16SrRNA序列比對方法進(jìn)行菌種鑒定，然后經(jīng)過人工培養(yǎng)和篩選得到能夠穩(wěn)定存在的菌種，投放到工業(yè)化生產(chǎn)中，使其對傳統(tǒng)手工制作的特色酸奶疙瘩工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的基礎(chǔ)，使得發(fā)酵乳食品對人體產(chǎn)生更高的營養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶疙瘩：新疆阿勒泰地區(qū)農(nóng)戶家購買的傳統(tǒng)手工制作。購買的酸奶疙瘩裝在事先滅菌好的采樣瓶中，低溫保存快速帶到實(shí)驗(yàn)室保存于冰箱中。

蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；溴甲酚紫（分析純）：北京京土恒盛商貿(mào)有限公司；硫酸錳（分析純）：天津市光復(fù)精迅化工研究所。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉4 g/L，吐溫-80 1.0 mL，KH2PO42.0 g/L，檸檬酸二胺2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水100 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，pH值為6.2，121 ℃條件下高壓滅菌15 min備用。用于乳酸菌的分離篩選及純化。

PY培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨5g/L，鹽溶液40mL/L，葡萄糖30g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L。鹽溶液成分：氯化鈣0.2 g/L，七水硫酸鎂0.48 g/L，磷酸氫二鉀1.0 g/L，碳酸氫鈉10.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，氯化鈉2.0 g/L。pH值為7.2，121℃條件下高壓滅菌15 min備用。用于乳酸菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162B電熱恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ無菌操作臺：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-60B離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見光光度計(jì)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；M313437恒溫?fù)u床：金壇市高科儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

用90mL蒸餾水將10g酸奶疙瘩樣品進(jìn)行溶解，然后在搖床中振蕩2 h，取酸奶樣品梯度稀釋，在7個(gè)試管中各加入9 mL蒸餾水，取樣品1 mL加入第一個(gè)試管，然后搖勻后取1 mL至第二個(gè)試管，然后依次取1 mL直至所有的梯度稀釋完，取10-5、10-6、10-7、10-8這四個(gè)稀釋度的懸液100 μL涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上四個(gè)對應(yīng)區(qū)域，用涂布棒推勻，在37℃，用燭缸法培養(yǎng)48h，連續(xù)進(jìn)行分離純化3次后挑取單個(gè)菌落，接種于MRS培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)24 h。觀察記錄培養(yǎng)基中單菌落的形態(tài)，革蘭氏染色后的細(xì)胞形態(tài)特征，并進(jìn)行過氧化氫酶反應(yīng)試驗(yàn)。將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶觸反應(yīng)試驗(yàn)陰性的桿菌或球菌，初步定為疑似乳酸菌的菌株，并進(jìn)一步純化、培養(yǎng)和保藏。

1.3.2 菌種的菌落形態(tài)鑒定

在潔凈的載玻片上滴加一滴蒸餾水，用滅菌好并冷卻后的接種環(huán)挑取單菌落涂均勻涂抹于載玻片上，然后干燥固定。初染時(shí)加草酸胺結(jié)晶紫一滴，約1 min后水洗；媒染時(shí)滴加碘液沖去玻片上殘留的蒸餾水，并覆蓋約1 min，同樣用蒸餾水水洗；脫色時(shí)將載玻片上面的蒸餾水甩盡，用用體積分?jǐn)?shù)為95%酒精滴加沖洗至流出酒精剛好不出現(xiàn)紫色為止，脫色時(shí)間約為20～30 s，然后用蒸餾水沖洗把玻片上的酒精沖洗干凈；復(fù)染時(shí)用番紅液染30 s，然后用蒸餾水沖洗；等到切片干燥后加蓋玻片封片，并做好標(biāo)記。滴加松柏油一滴，然后置于油鏡下觀察。

挑取單菌落于潔凈的載玻片上，然后滴加一滴3%過氧化氫，觀察有無氣泡產(chǎn)生，不產(chǎn)生氣泡為陰性，可初步判斷為疑似乳酸菌的菌株。

1.3.3 菌種生理生化鑒定[11-13]

溫度生長試驗(yàn)：將培養(yǎng)24 h后的乳酸菌懸液以5%的量接種于pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，分別放置于5℃，10℃、40℃、45℃中靜置培養(yǎng)。5℃、10℃培養(yǎng)14 d，40℃、45℃培養(yǎng)7 d，觀察生長情況。每24 h取一次樣，于波長600 nm條件下測定吸光度度值，每次測3組平行樣并計(jì)算平均值。

產(chǎn)酸與產(chǎn)氣試驗(yàn)：在PY培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入40 g/L葡萄糖酸鈉，0.5 mL/L吐溫80，6 g瓊脂，14 mL/L溴甲酚紫做成軟瓊脂，置于112℃滅菌20～30 min備用。將活力強(qiáng)的乳酸菌菌液接種滴加在軟瓊脂柱內(nèi)混勻，在表面加蓋一層約7 mm厚的2%瓊脂，30℃培養(yǎng)24～36 h，即可觀察乳酸菌產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的情況。

耐酸與耐鹽試驗(yàn)：接種前每個(gè)pH取6 mL MRS培養(yǎng)基做空白對照。分別將菌液接種在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d觀察菌株生長情況。在NaCl含量為3.0%和6.5%的MRS液體培養(yǎng)基中接種菌株培養(yǎng)7 d觀察菌株的耐鹽能力。每24 h取一次樣，于波長600 nm條件下測定吸光度值，每次測3組平行樣并計(jì)算平均值。

碳源發(fā)酵試驗(yàn)：使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管來觀察乳酸菌的碳源發(fā)酵情況，在使用時(shí)用磨砂輪將管的一段折斷，然后用用滅菌并冷卻好的接種針進(jìn)行純菌種的接種，用封口膜將管口進(jìn)行密封，然后整齊的置于小燒杯中放在35℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，18～24 h后觀察記錄結(jié)果即可。

1.3.4 菌種16S rDNA鑒定[14-15]

采用16SrDNA序列分析方法對菌種進(jìn)行鑒定，釆用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑進(jìn)行提取，然后按照Axygen公司說明書進(jìn)行操作。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系及程序：在95℃下進(jìn)行預(yù)變性3 min，94℃下進(jìn)行變性1 min，60℃退火30 s，最后在72℃下延伸2 min，從變性到延伸需要30個(gè)循環(huán)，其中上游引物為FA-27F（5'-GCA GAGTTCTCG GAG TCA CGA AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3'），下游引物為RA-1495R（5'-AGCGGATCACTT CAC ACA GGA CTA CGG GTA CCT TGT TAC GA-3'）。

PCR產(chǎn)物電泳檢測：PCR產(chǎn)物與等量的染色液混合，取其5μL，用1%瓊脂糖凝膠作為載體進(jìn)行電泳，電壓為100V，電泳時(shí)間1 h，檢測是否有特異性條帶，并將PCR產(chǎn)物送到武漢華大基因測序。用MEGA5.0軟件對基因序列進(jìn)行分析，然后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離及形態(tài)觀察[14]

對酸奶疙瘩樣品中微生物進(jìn)行分離，得到1株乳酸菌，將其命名為SA。菌株SA的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征見圖1。由圖1A可知，分離純化后菌株SA的菌落呈乳白色、有光澤、表面光滑，不透明、圓形隆起、邊緣整齊。由圖1B可知，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察菌株SA菌落呈紫色、短桿狀、兩端鈍圓、無芽孢、成對或呈短鏈狀、染色呈革蘭氏陽性。

圖1 菌株SA的菌落形態(tài)(A)及細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.1 Colonial morphology(A)and cell morphology(B)of stain SA

2.2 生理生化鑒定

對分離得到的乳酸菌SA進(jìn)行生理生化特性分析，具體結(jié)果見表1。

表1 菌株SA的生理生化特性分析結(jié)果Table 1 Analysis results of physiological and biochemical characteristics of strain SA

由表1可知，該株菌種產(chǎn)氣產(chǎn)酸，屬于異型發(fā)酵。在5℃條件下菌株的生長緩慢，在40℃時(shí)菌株的生長速度最快，能夠耐受3%的NaCl，在pH6.0條件下生長旺盛。菌株SA的碳源發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示該乳酸菌菌種不能發(fā)酵山梨糖、衛(wèi)茅糖、赤鮮糖、鼠李糖、淀粉、半乳糖和葡萄糖酸鹽，而能夠利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖等大多數(shù)的糖類。

2.3 16S rDNA鑒定結(jié)果

以乳酸菌株SA基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知，待測菌條帶明亮清晰，且無明顯拖尾，均在1500bp附近，與預(yù)期擴(kuò)增大小一致，說明擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行下一步16S rDNA基因序列的測定。

圖2 菌株SA 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification product of strain SA

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株SA的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SA based on 16S rDNA gene sequence

由圖3可知，基因序列測定后，將乳酸菌菌株的16SrDNA基因測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中利用BLAST軟件進(jìn)行分析，可以得出分離菌株SA與Weissella cibariaKACC 11862 AEKT01000037聚為一類，其同源性為99%，故將菌株SA鑒定為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）。

3 結(jié)論

通過純培養(yǎng)的方式對酸奶疙瘩樣品中的微生物進(jìn)行分離，得到1株生長狀況良好的乳酸菌株命名為SA。菌株SA的菌落呈乳白色、有光澤、表面光滑，不透明、圓形隆起、邊緣整齊。鏡檢觀察菌株SA菌落呈紫色、短桿狀、兩端鈍圓、無芽孢、成對或呈短鏈狀，革蘭氏染色結(jié)果呈陽性。將菌株SA經(jīng)過生理生化鑒定、16S rDNA基因測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行分析，可以得出該株菌株為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）。該菌株最適生長條件為溫度40℃、pH 6.0、并且能夠耐受3%的NaCl。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria in yogurt pimple from Aletai prefecture of Xinjiang

LIU Junfeng1,2,YIN Xue1,GUO Xuefeng1,2*
(1.College of Animal Science,Tarim University,Alar 843300,China;2.Key Laboratory of Tarim Animal Science and Technology,Xinjiang Production&Construction Corps,Alar 843300,China)

Strain SA isolated and screened in yogurt pimple produced by herdsmen from Aletai prefecture of Xinjiang,was preliminarily determined as a lactic acid bacterium by catalase tests.Strain SA was researched by colony and cell morphology,physiological and biochemical characteristics,16S rDNA gene sequences and phylogenetic tree analysis.The results showed that isolated strain SA was clustered into one class withWeissella cibariaKACC 11862 AEKT01000037,and the homology was 99%.Strain SA was identified asWeissella cibaria.The optimum growth conditions of strain SA was culture temperature 40℃and pH 6.0,it could tolerate 3%NaCl.

lactic acid bacteria;isolation;identification

Q815

0254-5071（2017）09-0116-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.025

2017-06-23

兵團(tuán)科技創(chuàng)新中青年領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（2016BC001）；兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（HS201613）

劉俊峰（1980-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理與毒理學(xué)。

*通訊作者：郭雪峰（1980-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料學(xué)。