水果酵素對小鼠酒精性肝損傷保護作用的研究

馮 莉，張鶴鑫，何國庫，徐懷德，雷宏杰*

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.東莞市赫群生物科技有限公司，廣東 東莞 523000）

水果酵素對小鼠酒精性肝損傷保護作用的研究

馮 莉1，張鶴鑫1，何國庫2，徐懷德1，雷宏杰1*

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.東莞市赫群生物科技有限公司，廣東 東莞 523000）

該試驗研究了小鼠酒精性肝損傷模型的建立以及水果酵素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用。結果表明，連續白酒灌胃可引起小鼠肝臟損傷，表現為肝臟指數和血清指數升高、肝臟過氧化物含量升高、肝臟抗氧化能力降低以及肝細胞腫脹和脂肪變性等。與模型組相比，不同濃度的水果酵素均可有效恢復肝臟指數、降低血清中谷草轉氨酶（GOT）、谷丙轉氨酶（ALT）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙二醛（MDA）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平。病理學觀察結果顯示肝臟脂肪變性得到改善，肝臟細胞排列較為整齊，組織結構趨于正常，說明水果酵素可預防和修復酒精對小鼠肝臟的損傷，具有一定的保肝效果。

水果酵素；抗氧化；脂肪代謝；保護作用

飲酒過量是長期困擾全球的重要公共衛生問題，也是導致肝臟疾病爆發的主要原因。我國酒文化歷史悠久，是酒品的消費大國，隨著我國居民生活水平的提高，飲食結構發生了巨大的變化，尤其是酒精的攝入量逐年增長，相應的酒精性肝損傷的發病率也日益攀升。酒精性肝損傷的發病機制非常復雜，呈現多層次、多途徑、多方面的損傷[1-5]，涉及到酒精代謝產物引起的損傷、炎癥反應、氧化應激及脂質過氧化等，發病早期如脂肪肝和肝炎尚可逆轉，一旦惡化至肝硬化，肝臟損傷不僅不可逆轉，而且除肝移植外尚缺乏有效的治療措施[6-9]。因此，酒精性肝損傷的防治是醫學上的一個重要難題。

酵素是以一種或多種蔬菜、水果、食用菌、中草藥等為原料，經多種益生菌發酵而成的，富含生物酶、礦物質、維生素以及次生代謝產物等的功能性生物發酵產品，酵素可加速人體內生化反應進程，但不會改變生化反應的方向和最終產物的理化性質[10-11]。酵素是維持生命活動正常進行的一種必需的物質，但是生物體內的酵素水平會隨著年齡的增長而減少，從而引發機體的快速衰老，增加患病的風險，適當補充酵素可保持機體的基本功能和良好狀態[12]。目前，初步研究證實植物酵素具有平衡機體、消炎抗菌、美白抗衰老、改善胃腸道、解酒護肝等多種保健功能[13-17]。

本研究以水果酵素為研究對象，該水果酵素是由多種水果（包括黑醋栗、蘋果、紅醋霉、楊桃、蔓越莓、萊姆、鳳梨、柳丁、香蕉、黑莓、奇異果、木瓜、葡萄柚、百香果、草莓、香吉士、柑橘、柚子、柿子、覆盆莓、李子、梅子、梨、酪梨、番茄、棗、檸檬、藍莓）經復合菌種（酵母菌、雙歧桿菌、乳桿菌）發酵而成，其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性為665.80 U/mL。旨在探討水果酵素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用，為進一步研究和開發水果酵素的保健功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雄性昆明小鼠144只，體質量（30±2）g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。飼養條件：溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，照明時間12 h/d。

水果酵素：某公司生產；水飛薊素：德國馬博士大藥廠；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；紅星二鍋頭：北京紅星股份有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；E100生物顯微鏡：尼康有限公司；UV-1780紫外可見分光度儀：日本島津儀器有限公司；7180型全自動生化分析儀：日本日立高新技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小鼠酒精性肝損傷模型的建立與分組

試驗小鼠適應性喂養7 d后，將小鼠隨機分為6組：正常組、模型組、水飛薊素陽性對照組（50mg/kg）、水果酵素低劑量組（原液稀釋4倍，10 mL/kg）、中劑量組（原液稀釋2倍，10 mL/kg）、高劑量組（原液，10 mL/kg）。每組24只。各陽性對照組和樣品組每天灌胃一次，正常組和模型組每天灌胃等量的生理鹽水，持續14d。小鼠每周稱體質量2次，根據體質量的變化及時調整灌胃量。模型組、陽性對照組和樣品組于第15天開始，灌胃體積分數為30%乙醇。正常組灌胃等量生理鹽水。各模型組、陽性對照組和樣品組在灌胃間隔4 h以上再灌胃乙醇，持續28 d。具體方案見表1。

表1 實驗動物分組及灌胃方式Table 1 Grouping of experimental animals and intragastric administration method

1.3.2 樣品的采集與處理

于最后一次灌胃后，各組試驗小鼠禁食不禁水16 h，然后對各組小鼠進行稱質量，眼球取血，收集血液，4℃、4 000 r/min離心15 min，血清于4℃保存。頸椎脫臼處死小鼠后解剖取肝臟，用預冷的生理鹽水（4℃）清洗，濾紙拭干，稱質量，取肝左葉組織用4%多聚甲醛進行固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光學顯微鏡下檢查組織病理學變化；取剩余部分肝組織，用預冷生理鹽水（4℃）制備10%肝臟組織勻漿。

1.3.3 檢測指標及方法

（1）小鼠肝臟指數

（2）肝臟病理學檢查

于400倍光學顯微鏡下觀察肝細胞的形態變化、炎癥反應、纖維化、脂肪空泡等病理變化。

（3）生化指標檢測

采用全自動生化分析儀測定血清中谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）活性等肝功能指標與血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量等肝臟脂肪代謝指標；按照試劑盒說明書測定肝勻漿丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）活性等肝臟抗氧化能力指標。

1.3.4 數據分析方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計和差異顯著性分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠肝臟指數及肝功能的變化

在整個試驗過程中，正常組小鼠的飲食和排泄表現正常，無死亡現象。但在乙醇灌胃期間，模型組、水飛薊素陽性對照組、水果酵素組均表現出不同程度的反常現象。尤其是模型組的小鼠行動遲緩、毛發凌亂、光澤度差，而陽性對照組和水果酵素組小鼠的狀態與模型組相比，均有不同程度的改善。由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠的肝臟指數升高了35%，其原因是長期的酒精灌胃使小鼠的肝臟發生了肝腫脹現象。而與模型組相比，陽性對照組和水果酵素組的小鼠肝臟指數均有所降低（降低了21%～24%），其中水果酵素高劑量組的肝臟指數下降效果更顯著，接近正常組的肝臟指數水平。

ALT和GOT是存在于肝臟細胞質和線粒體中兩種重要的轉氨酶，正常情況下其在血清中的含量很低，當肝細胞受損或壞死時，ALT和GOT就會滲入血液中。因此，血清中ALT和GOT水平的高低是反應肝臟細胞受損程度的特異性指標，也是臨床上常用的肝功能評價指標[18-19]。由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠的ALT和GOT活性顯著升高，分別升高了108%和38%，說明小鼠酒精性肝損傷模型的建立成功。與模型組相比，陽性對照組和水果酵素高劑量組小鼠血清中的ALT和GOT活性均顯著降低，尤其是水果酵素高劑量組小鼠，其血清中的ALT和GOT已接近正常組水平，僅分別比正常組高5%和4%。表明水果酵素在一定程度上能夠改善肝細胞膜的通透性，抑制肝細胞受損、壞死。

表2 水果酵素對小鼠血清ALT和GOT活性及肝臟指數的影響Table 2 Effect of fermented fruit beverage on the ALT,GOT activity and liver index in mice

2.2 小鼠肝臟脂肪代謝的變化

肝臟是酒精和脂肪的代謝場所，酒精的過度攝入會造成肝臟脂肪代謝功能降低，導致脂類物質在肝臟內堆積，進而造成肝臟的脂肪性病變，直接導致血液中TG、TC含量上升。由于HDL-C和LDL-C與體內膽固醇的運輸有關，因此其含量會隨著血液中TG、TC含量的變化而波動[20-21]。

表3 水果酵素對小鼠肝臟脂肪代謝的影響Table 3 Effect of fermented fruit beverage on the fat metabolism of liver in mice mmol/L

由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中的TG、TC含量顯著升高，分別升高了142%和63%。但水飛薊素或水果酵素均可降低小鼠血清中的TG、TC含量，水飛薊素和水果酵素高劑量組的效果尤為明顯，且效果相當，與模型組相比，水飛薊素和水果酵素高劑量組可降低TG和TC含量分別約56%和26%。與正常組相比，模型組小鼠血清中LDL-C含量顯著上升，升高了150%，而HDL-C含量顯著下降，下降了30%。與模型組相比，水飛薊素和水果酵素均可不同程度上恢復小鼠血清中的LDL-C和HDL-C水平，而且水飛薊素和水果酵素高劑量組的效果較好，可降低LDL-C含量約32%，升高HDL-C含量至少38%以上。結果表明，水果酵素能夠促進肝臟內脂肪的轉化，加速脂蛋白在機體內運輸膽固醇的速度，最終起到調節脂肪代謝的作用。

2.3 小鼠肝臟抗氧化能力的變化

乙醇在線粒體中的氧化過程中，其代謝產物乙醛能夠誘導細胞色素活性增強，產生大量的自由基，不飽和脂肪酸和膜膽固醇易于同自由基作用發生過氧化反應[22-24]。脂質過氧化物中以MDA較為重要，其含量的高低代表肝細胞受損時出現的氧化作用的強弱，組織中MDA含量越高，氧化活性越強，組織受損程度就越大，同時還會大量消耗機體的SOD和GSH，這兩種酶對維持機體的氧化損傷平衡起到至關重要的作用，是清除機體自由基的主要酶類[25-26]。如表4所示，與正常組相比，模型組小鼠肝臟中的過氧化物MDA含量明顯升高，升高了100%。而給予水飛薊素及不同濃度的水果酵素均可顯著降低肝臟組織中的MDA水平，尤其是高濃度的水果酵素效果最佳，與模型組相比，可降低MDA約61%，與正常組一致。模型組小鼠肝臟組織中的SOD、GSH-PX活性與正常組相比，均呈現顯著下降趨勢，分別下降了49%和60%。與模型組相比，水飛薊素和水果酵素處理均可顯著提高SOD、GSH-PX活性，最大分別約40%和70%，但仍低于正常組水平。

表4 水果酵素對小鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of fermented fruit beverage on the antioxidant capacity of liver in mice

2.4 小鼠肝臟組織病理的變化

HE染色結果如圖1所示，正常組小鼠的肝小葉結構清晰、完整，肝細胞排列整齊、大小正常，胞漿均勻，無炎癥細胞浸潤，無明顯的肝組織變性、水腫、壞死等現象。模型組小鼠肝組織病理損傷嚴重，肝組織出現水腫、壞死及炎癥細胞浸潤，肝小葉結構紊亂，肝索排列不規則，表現出輕度的纖維化和毛細血管擴張等。與模型組相比，水果酵素低劑量組小鼠的肝細胞氣球樣變及細胞水腫癥狀有所改善，但肝小葉結構仍然混亂。中劑量、高劑量水果酵素組的小鼠肝臟脂肪變性得到改善，肝臟排列較為整齊，組織結構趨于正常。

圖1 水果酵素對小鼠肝臟組織病理損傷的影響Fig.1 Effect of fermented fruit beverage on the pathological injury of liver in mice

3 結論

持續乙醇灌胃可引起小鼠肝臟損傷，表現為血清指數含量升高、肝臟過氧化物含量升高、肝臟抗氧化能力降低、以及肝細胞腫脹和脂肪變性，反映了酒精性肝損傷的生化和病理特征。而水果酵素可有效恢復肝臟指數、降低血清中GOT、ALT、TG、TC、LDL-C、MDA水平，提高HDL-C、SOD、GSH-PX水平，肝臟脂肪變性得到改善，肝臟細胞排列較為整齊，組織結構趨于正常。因此，水果酵素可有效預防和修復酒精對小鼠肝臟的損傷。

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Protective effects of fermented fruit beverage on alcoholic liver injury in mice

FENG Li1,ZHANG Hexin1,HE Guoku2,XU Huaide1,LEI Hongjie1*
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Dongguan Herzgroup Biological Technology Co.,Ltd.,Dongguan 523000,China)

The establishment of model of alcoholic liver injury in mice and the protective effect of fermented fruit beverage on alcoholic liver injury in mice were researched.Results showed that feedingBaijiu(Chinese liquor)could cause mice liver injury by increasing liver index,serum index and liver peroxide content,decreasing liver antioxidant capacity,hepatocellular swellinge and fatty degeneration.Compared to the model group,different concentrations of fermented fruit beverage could effectivelyrestore liver index,decrease glutamic oxalacetic transaminase(GOT),alanine transaminase(ALT),triglyceride(TG),total cholesterol(TC),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)and malondialdehyde(MDA)in serum,and increase high density lipoprotein cholesterol(HDL-C),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px).Results of pathological observation showed liver fatdegeneration wasimproved,the liver cellswere aligned,the organizationalstructure tendsto be normal,which fermented fruit beverage could prevent and repair alcoholic liver injury in mice,and had certain protective effect on liver.

fermented fruit beverage;antioxidation;fat metabolism;protective effect

TS255.4

0254-5071（2017）09-0112-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.024

2017-05-03

校企合作橫向課題（K403021513）

馮 莉（1988-），女，博士研究生，研究方向為果蔬加工。

*通訊作者：雷宏杰（1984-），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術、食品發酵與釀造。