醬香型白酒第二輪次酒發(fā)酵過(guò)程微生物多樣性研究

黃蘊(yùn)利，黃永光*，胡建峰，胡 峰，鐘方達(dá)

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

醬香型白酒第二輪次酒發(fā)酵過(guò)程微生物多樣性研究

黃蘊(yùn)利1，2，黃永光1，2*，胡建峰3，胡 峰3，鐘方達(dá)3

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

為探究醬香型白酒二輪次發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化、微生物多樣性以及物種與樣品之間的關(guān)系，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒第二輪次酒生產(chǎn)堆積及窖池發(fā)酵過(guò)程酒醅中微生物的多樣性及其主要功能菌群進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在堆積過(guò)程中共檢測(cè)到細(xì)菌138個(gè)屬，真菌54個(gè)屬；窖池發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到細(xì)菌262個(gè)屬，真菌267個(gè)屬。酒醅中主要細(xì)菌類(lèi)群為Firmicutes和Proteobacteria，主要真菌類(lèi)群為Ascomycota和Basidiomycota。堆積過(guò)程中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus；絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬有Thermoascus、Thermomyces、Candida、Aspergillus。在窖池發(fā)酵酒醅中其絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus；絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌屬為Saccharomyces、Candida、Penicillium、Fusarium。由于堆積、窖池發(fā)酵酒醅所處發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵物料物態(tài)及其工藝參數(shù)差異較大原因，使得兩者之間生物物種存在較大差異。

醬香型白酒；高通量測(cè)序；酒醅；微生物群落多樣性

中國(guó)白酒釀造工藝是固態(tài)條件下獨(dú)特而復(fù)雜的自發(fā)發(fā)酵過(guò)程[1-2]。中國(guó)白酒類(lèi)是使用谷物（如高粱、小麥和大麥）進(jìn)行同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）的過(guò)程。同步糖化發(fā)酵結(jié)合酶解淀粉為還原糖，為微生物提供大量的碳源[3]。此外，白酒發(fā)酵過(guò)程含有多種微生物，包括酵母、細(xì)菌和絲狀真菌[4]。復(fù)雜的絲狀真菌群落產(chǎn)生多種水解酶降解淀粉為多糖，包括葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和蜜二糖[5]。由于微生物的代謝活動(dòng)和固體培養(yǎng)基的低導(dǎo)熱性使發(fā)酵劑溫度能達(dá)到50℃的高溫[6]。此外，在酒精發(fā)酵階段有兩個(gè)因素影響微生物的生長(zhǎng)，一是低的pH值（pH3.0），二是產(chǎn)生的乙醇（4.5%vol～5.5%vol）抑制微生物的生長(zhǎng)[7]。這樣的惡劣同步糖化發(fā)酵（SSF）環(huán)境導(dǎo)致具有特定的生理特性和性能的微生物得到富集[8]，特別是具有獨(dú)特的耐熱和耐酸性能的微生物[9]。第二輪次酒能夠增加基酒中酒體的曲香味，能夠使糟醅中累積更多的微生物代謝產(chǎn)物，有利于基酒香味物質(zhì)的積累，在后期輪次相應(yīng)形成更多的醬香型酒前驅(qū)物質(zhì)，同時(shí)為后期輪次多產(chǎn)醬香奠定基礎(chǔ)。

在20世紀(jì)80～90年代，許多關(guān)于酒醅微生物的研究主要是通過(guò)傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法進(jìn)行的[10]。然后在接下來(lái)的十年中，開(kāi)始采用不可培養(yǎng)方法對(duì)酒醅中的微生物群落進(jìn)行研究[11-12]。然而，這些文獻(xiàn)報(bào)道的主要是通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因或變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）的克隆文庫(kù)進(jìn)行研究。DGGE的局限性存在一個(gè)條帶內(nèi)可能含有多個(gè)物種，很難清晰鑒別[13]。16SrRNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建，屬于勞動(dòng)密集型方法，只允許分析有限數(shù)量的16S rRNA基因序列[14]。由于這些常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的固有局限性，應(yīng)用這些方法去認(rèn)識(shí)酒醅中復(fù)雜的微生物生態(tài)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此，需要采用更科學(xué)系統(tǒng)的方法才能全面了解酒醅發(fā)酵過(guò)程的微生物多樣性和主要功能群落的分布。高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughputsequencing，HTS）的最新進(jìn)展使得能夠通過(guò)對(duì)許多樣品進(jìn)行平行的深入分析，以更低的成本和更易加工來(lái)顯著提高生產(chǎn)率。16SrRNA區(qū)域的擴(kuò)增與高通量多序列讀取的產(chǎn)生能夠獲得覆蓋完全的微生物群落[15]。目前，這種新興技術(shù)已被用于研究不同發(fā)酵食品中的微生物生態(tài)，包括醋[16]和牛奶[17]以及濃香型白酒[18]和清香型白酒中[19-20]。郭敏等[21]也證實(shí)了高通量測(cè)序技術(shù)可用于醬香型白酒釀造發(fā)酵過(guò)程酒醅微生物多樣性的研究。

本研究旨在通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)研究分析醬香型白酒第二輪次發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌16S rRNA和真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）高變區(qū)，研究生產(chǎn)堆積、窖池發(fā)酵酒醅中的微生物多樣性及其主要功能群落結(jié)構(gòu)，深入認(rèn)識(shí)發(fā)酵過(guò)程的微生物的多樣性及其所形成的發(fā)酵機(jī)理，為傳統(tǒng)白酒釀造、固態(tài)發(fā)酵及食品發(fā)酵工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅：取自XJ醬香型白酒第二輪次酒生產(chǎn)堆積、窖池發(fā)酵酒醅，共25個(gè)酒醅樣品；DNA提取試劑盒：美國(guó)Omega Bio-Tek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；Heraeus Multifuge X3高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；HQ-60-Ⅱ漩渦混合器：北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；ABIGeneAmpR9700型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；IlluminaMiseq 測(cè)序平臺(tái)：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣方法

堆積過(guò)程酒醅的取樣周期為1 d，收堆時(shí)計(jì)為0 d，取樣點(diǎn)如圖1所示，即上層A點(diǎn)（代表堆子上部一個(gè)層面）；中層B、C兩點(diǎn)取樣混勻后作為一個(gè)樣品（代表堆子中部層面）；下層D、E兩點(diǎn)取樣混勻后作為一個(gè)樣品（代表堆子下部層面）。窖池發(fā)酵過(guò)程酒醅取樣周期為5 d，入池時(shí)計(jì)為0 d，以后每隔5 d取樣一次，同一層面分別確定三個(gè)取樣點(diǎn)（見(jiàn)圖2）；將同一層面的A、B、C三點(diǎn)所取酒醅混勻?yàn)橐粋€(gè)樣品，D、E、F三點(diǎn)所取酒醅混勻?yàn)橐粋€(gè)樣品，G、H、I三點(diǎn)的取酒醅混勻?yàn)橐粋€(gè)樣品，分別代表窖池中上、中、下三個(gè)層面的酒醅樣品。

圖1 堆積酒醅取樣點(diǎn)Fig.1 Sampling points of fermented grains in the accumulation process

圖2 窖池發(fā)酵酒醅取樣點(diǎn)Fig.2 Sampling points of fermented grains in the fermentation process

1.3.2 樣品預(yù)處理及DNA提取

分別稱(chēng)取每個(gè)樣品10 g，用15 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）懸浮，加入三顆玻璃珠，漩渦振蕩10 min。300 r/min離心5 min，取上清，沉淀用PBS緩沖液重復(fù)洗滌3次，離心后收集上清，混勻所收集上清。將上清于12 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。用5 mL PBS緩沖液洗3次沉淀，每次于12 000 r/min離心5 min后去上清，收集并混勻沉淀[22]。

應(yīng)用土壤總DNA提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提示，進(jìn)行堆積、窖池發(fā)酵酒醅樣品中提取的微生物細(xì)胞的總DNA提取。

1.3.3 16S rRNA、ITS基因擴(kuò)增

細(xì)菌使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA G-3'）和806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增V4高變區(qū)，真菌使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3'）和2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴(kuò)增高變區(qū)。20μLPCR混合體系中含F(xiàn)astPfu聚合酶0.4μL，前引物（5 μmol/L）0.8 μL，后引物（5 mmol/L）0.8 μL，5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（de-oxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL和10 ng模版脫氧核糖核酸（DNA）。PCR條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s；55 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸45 s；共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.4 Illumina Miseq測(cè)序

將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，再按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。再應(yīng)用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計(jì)

利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)得到樣品雙端序列數(shù)據(jù)，在進(jìn)行reads拼接以及對(duì)reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾后，從25個(gè)樣品中分別獲得細(xì)菌、真菌的有效序列分別為874 809條和793 524條。

2.2 基于OTU的聚類(lèi)分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

通過(guò)USEARCH將標(biāo)簽分組成具有97%相似性的個(gè)分類(lèi)單位（operational taxonomic units，OTU）。計(jì)算Chao和ACE指數(shù)（以確定物種豐富度），Shannon和Simpson指數(shù)（以確定物種多樣性）以及檢測(cè)到的物種數(shù)目，以描述堆積、窖池發(fā)酵酒醅樣品中細(xì)菌、真菌群落的多樣性。

（1）稀疏曲線分析

圖3 各酒醅樣品細(xì)菌(A)及真菌(B)的稀疏曲線Fig.3 Dilution curves of bacteria(A)and fungi(B)in different fermented grains samples

稀疏性曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線。它可以用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。25個(gè)酒醅樣品中細(xì)菌、真菌的稀疏曲線（rarefaction curve）見(jiàn)圖3。

由圖3A可知，25個(gè)酒醅樣品細(xì)菌的稀釋曲線都趨向平坦，說(shuō)明各樣本細(xì)菌的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度已足夠。由圖3B可知，25個(gè)酒醅樣品真菌的稀釋曲線趨向平坦，說(shuō)明各樣品真菌的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度已足夠。

（2）Shannon-Wiener曲線分析

Shannon-Wiener是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。25個(gè)酒醅樣品細(xì)菌、真菌的Shannon-Wiener曲線見(jiàn)圖4。

圖4 各酒醅樣品細(xì)菌(A)及真菌(B)的Shannon-Wiener曲線Fig.4 Shannon-Wiener curves of bacteria(A)and fungi(B)in different fermented grains samples

由圖4A可知，25個(gè)酒醅樣品細(xì)菌的Shannon-Wiener曲線都趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序的數(shù)據(jù)量足夠大，對(duì)酒醅中微生物多樣性分析基本覆蓋酒醅中細(xì)菌的種類(lèi)。由圖4B可知，25個(gè)酒醅樣品真菌的Shannon-Wiener曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序的數(shù)據(jù)量足夠大，對(duì)酒醅中微生物多樣性分析基本覆蓋酒醅中真菌的種類(lèi)。

2.2.2 OTU分布Venn圖分析

堆積和窖池上、中、下層發(fā)酵酒醅樣品的細(xì)菌、真菌群落多樣性結(jié)構(gòu)OTU分布Venn圖見(jiàn)圖5。

由圖5A可知，四組樣品共有的OTU有153個(gè)，分別占堆積、窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品OTU總數(shù)的63.75%、37.05%、36.60%和38.06%。窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品所共有的OTU為347，分別占窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品OTU總數(shù)的84.02%、83.01%和86.32%；堆積和窖池發(fā)酵共有的OTU相對(duì)較少，而窖池發(fā)酵上、中、下三層共有的OTU相對(duì)較多，說(shuō)明堆積和窖池發(fā)酵過(guò)程酒醅中細(xì)菌菌群多樣性相差較大，而窖池內(nèi)發(fā)酵酒醅的菌群多樣性相差不大。

由圖5B可知，四組酒醅樣品共有的OTU為55，四組酒醅樣品的OTU分別占堆積、窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品OTU總數(shù)的48.25%、12.97%、13.75%和12.53%。窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品所共有的OTU為179，上、中、下三層酒醅樣品的OTU分別占窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品OTU總數(shù)的42.22%、44.75%和40.77%；說(shuō)明大多數(shù)真菌是在窖池發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生或相對(duì)數(shù)量呈現(xiàn)增加，且窖池上、中、下三層酒醅樣品的真菌也存在較大差異。

2.3 微生物群落多樣性結(jié)構(gòu)分析

堆積和窖池發(fā)酵酒醅樣品細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)分類(lèi)、屬分類(lèi)水平上的結(jié)果分別見(jiàn)圖6和圖7。

由圖6可知，酒醅樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成情況，對(duì)堆積和窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品中主要細(xì)菌類(lèi)群（相對(duì)豐度＞1%）統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，堆積和窖池發(fā)酵酒醅樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分類(lèi)比較明顯，均為Firmicutes。在堆積、窖池發(fā)酵酒醅樣品中，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度均占92%以上；堆積酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有Bacillus（29.22%），Enterococcus（15.46%），Lactococcus（12.82%），Lactobacillus（10.31%），Lentibacillus（8.99%），Kroppenstedtia（6.13%），Enterobacteriaceae（4.8%），Alkaliphilus（2.59%），Oceanobacillus（1.44%），Thermoactinomyces（1.37%），而窖池發(fā)酵上層酒醅中存在的主要細(xì)菌屬類(lèi)有Lactobacillus（88.86%）、Acetobacter（3.12%）、Bacillus（1.97%），窖池發(fā)酵中層酒醅中的主要細(xì)菌屬類(lèi)有Lactobacillus（93.29%）、Bacillus（1.48%），窖池發(fā)酵下層酒醅中的主要細(xì)菌屬類(lèi)有Lactobacillus（95.21%）。

圖5 各酒醅樣本細(xì)菌(A)及真菌(B)的OTU分布Venn圖Fig.5 Venn diagram of OTU distribution of bacteria(A)and fungi(B)in different fermented grains samples

圖6 門(mén)水平(A)及屬水平(B)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Structure diagram of bacterial community of phylum level(A)and genus level(B)

表1 堆積和窖池發(fā)酵酒醅樣品中的主要細(xì)菌類(lèi)群Table 1 Main bacterial groups in fermented grains samples of accumulation and pits fermentation process

圖7 門(mén)水平(A)及屬水平(B)真菌群落結(jié)構(gòu)圖Fig.7 Structure diagram of fungi community of phylum level(A)and genus level(B)

由圖7可知，樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成情況，對(duì)堆積和窖池發(fā)酵上、中、下三層酒醅樣品中的主要真菌類(lèi)群（相對(duì)豐度＞1%）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 堆積和窖池發(fā)酵酒醅樣品中的主要真菌類(lèi)群Table 2 Main fungi groups in fermented grains samples of accumulation and pits fermentation process

續(xù)表

由表2可知，堆積和窖池發(fā)酵酒醅樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)類(lèi)比較明顯，均為Ascomycota。在堆積和窖池發(fā)酵酒醅樣品中，Ascomycota相對(duì)豐度均在96%以上；堆積過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌屬有Thermoascus（28.32%），Thermomyces（25.50%），Eurotiales（24.19%），Candida（8.41%），Aspergillus（5.01%），Byssochlamys（4.65%），Rasamsonia（1.52%），Monascus（1.31%）；而窖池發(fā)酵上層酒醅中的主要真菌屬類(lèi)則為Saccharomyces（37.61%），Candida（31.01%），Penicillium（10.65%），F(xiàn)usarium（5.52%），Aspergillus（1.59%），Alternaria（1.40%）；窖池發(fā)酵中層酒醅中的主要真菌屬類(lèi)為Saccharomyces（44.59%），Candida（26.13%），Penicillium（13.34%），Plectosphaerellaceae（3.04%），Monascus（1.82%）；窖池發(fā)酵下層酒醅中的主要真菌屬類(lèi)為Saccharomyces（35.69%），Candida（25.62%），Penicillium（9.94%），Monascus（4.92%），Aspergillus（2.77%），Byssochlamys（1.86%），Phoma（1.74%），Alternaria（1.61%），Gibberella（1.55%），Thermomyces（1.31%），F(xiàn)usarium（1.27%），Eurotiales（1.03%），Microascaceae（1.00%）。

3 結(jié)論

堆積和窖池發(fā)酵過(guò)程酒醅中細(xì)菌多樣性相差較大，而窖池內(nèi)上、中、下三層發(fā)酵酒醅由于均處于厭氧發(fā)酵條件，其菌群多樣性相差不大。大多數(shù)真菌是在窖池發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生或其相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加而被檢測(cè)到，且真菌在窖池上、中、下三層酒醅中也存在較大的差異。

對(duì)比醬香型白酒第二輪輪次酒生產(chǎn)堆積、窖池發(fā)酵酒醅中微生物多樣性，結(jié)果表明，二者存在較大的差異，堆積過(guò)程中主要細(xì)菌（相對(duì)豐度＞10%）有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus，而窖池發(fā)酵過(guò)程中主要為L(zhǎng)actobacillus，其相對(duì)豐度＞80%；堆積過(guò)程中主要真菌（相對(duì)豐度＞10%）有Thermoascus、Thermomyces、Eurotiales，而窖池發(fā)酵過(guò)程中主要為Saccharomyces、Candida、Penicillium。主要是由于堆積、窖池發(fā)酵酒醅所處發(fā)酵環(huán)境、發(fā)酵物料物態(tài)及其工藝參數(shù)差異較大的緣故，堆積處于開(kāi)放式的好氧、兼氧環(huán)境條件下，可富集環(huán)境空氣中的微生物，且可與空氣接觸，有較豐富的氧濃度參與堆積發(fā)酵，而窖池發(fā)酵過(guò)程處于絕對(duì)厭氧條件，微生物的多樣性會(huì)隨發(fā)酵環(huán)境條件的變化而發(fā)生自控調(diào)節(jié)，部分微生物的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒精、酸類(lèi)等不斷積累，也會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，自然窖池酒醅中的微生物多樣性與堆積酒醅中的微生物多樣性出現(xiàn)明顯差異。

[1]ZHUS,LUX,JIK,et al.Characterization of flavor compounds in Chinese liquor Moutai by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J].Anal Chim Acta,2007,597(2):340-348.

[2]韓興林，張五九，李 紅.從標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單分析白酒香型的發(fā)展[J].中國(guó)釀造，2015，34（5）：1-6.

[3]BALLESTEROS M,OLIVA J M,NEGRO M J,et al.Ethanol production from paper material using a simultaneous saccharification and fermentation system in a fed-batch basis[J].World J Microbiol Biotechnol,2002,39(12):1843-1848.

[4]LI X R,MA E B,YAN L Z,et al.Bacterial and fungal diversity in the starter production process of Fen liquor,a traditional Chinese liquor[J].J Microbiol,2013,51(4):430-438.

[5]陳 筆.醬香型白酒釀造過(guò)程中霉菌群落結(jié)構(gòu)以及霉菌與酵母相互作用的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2014.

[6]GLASSEY I,WARD A C.Solid state fermentation[M].New York:Springer,2015,217-225.

[7]徐 巖.基于風(fēng)味導(dǎo)向技術(shù)的中國(guó)白酒微生物及其代謝調(diào)控研究[J].釀酒科技，2015（2）：1-11，16.

[8]WANG C L,SHI D J,GONG G L.Microorganisms in Daqu:a starter culture of Chinese Maotai-flavor liquor[J].World J Microbiol Biotechnol,2008,24(10):2183-2190.

[9]XING MENG,QUN WU,LI WANG,et al.Improving flavor metabolism ofSaccharomyces cerevisiaeby mixed culture withBacillus licheniformis for Chinese Maotai-flavor liquor making[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2015,42(10):1601-1608.

[10]趙 爽，楊春霞，竇 屾，等.白酒生產(chǎn)中釀酒微生物研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2012，31（4）：5-10.

[11]SUN W N,XIAO H Z,PENG Q,et al.Analysis of bacterial diversity of Chinese Luzhou-flavor liquor brewed in different seasons by Illumina Miseq sequencing[J].Ann Microbiol,2016,66(3):1293-1301.

[12]LI K,ZHANG Q,ZHONG X T,et al.Microbial diversity and succession in the Chinese Luzhou-flavor Liquor fermenting cover lees as evaluated by SSU rRNA profiles[J].Indian Microbiol,2013,53(4):425-431.

[13]LIN Y,TONG Z.Bacterial communities in different sections of a municipal wastewater treatment plant revealed by 16S rDNA 454 pyrosequencing[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(10):2681-2690.

[14]SUCHODOLSKI J S,DOWD S E,WILKE V,et al.16S rRNA gene pyrosequencing reveals bacterial dysbiosis in the duodenum of dogs with idiopathic inflammatory bowel disease[J].PLoS One,2012,7(6):e39333.

[15]POLKA J,REBECCHI A,PISACANE V,et al.Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by highthroughput sequencing of 16S rRNA amplicons[J].J Food Microbiol,2015,46(1):342-356.

[16]NIE Z,ZHENG Y,WANG M,et al.Exploring microbial succession and diversity during solid-state fermentation of Tianjin duliu mature vinegar[J].Bioresour Technol,2013,148(8):325-333.

[17]BOKULICH NA,AMIRANASHVILI L,CHITCHYAN K,et al.Microbial biogeography of the transnational fermented milk matsoni[J].Food Microbiol,2015,50(1):12-19.

[18]程 偉，吳麗華，徐亞磊，等.濃香型白酒釀造微生物研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2014，33（3）：1-4.

[19]張雙燕，廖永紅，紀(jì) 南，等.基于高通量測(cè)序技術(shù)分析北京清香型大曲微生物多樣性[J].中國(guó)釀造，2016，35（11）：49-53.

[20]雷振河.采用高通量測(cè)序技術(shù)分析清香型白酒釀造微生物[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（9）：164-167.

[21]郭 敏，黃永光，邱樹(shù)毅，等.高通量測(cè)序在醬香白酒微生態(tài)多樣性研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造，2017，36（5）：146-151.

[22]王海燕.PCR-DGGE技術(shù)對(duì)清香型汾酒微生物群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2014.

Microbial diversity of the second rounds liquid of Moutai-flavorBaijiuduring fermentation process

HUANG Yunli1,2,HUANG Yongguang1,2*,HU Jianfeng3,HU Feng3,ZHONG Fangda3
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Moutai Brewery(Group)Xijiu Co.,Ltd.,Xishui 564622,China)

In order to explore the changes of microbial community structure,microbial diversity and the relationship between species and samples in the second rounds liquid of Moutai-flavorBaijiuduring the fermentation process,the microbial diversity and its main functional flora in the fermented grains of Moutai-flavorBaijiusecond rounds liquid accumulation and pits fermentation process were researched by high-throughput sequencing technology.The results showed that the 138 genera of bacteria and 54 genera of fungi were detected in the accumulation process,and the 262 genera of bacteria and 267 genera of fungi were detected in the pits fermentation process.The main bacterial groups in the fermented grains were Firmicutes and Proteobacteria,and the main fungi groups were Ascomycota and Basidiomycota.In the accumulation process,the absolute dominant bacteria wereBacillus,Enterococcus,LactococcusandLactobacillus,and the absolute dominant fungi wereThermoascus,Thermomyces,CandidaandAspergillus.In the pits fermentation process,the absolute dominant bacteria wasLactobacillus,the absolute dominant fungi wereSaccharomyces,Candida,PenicilliumandFusarium.Due to the great difference of fermented grains in accumulation,fermentation environment,fermentation material state,process parameters and pits fermentation process,there were significant differences in biological species.

Moutai-flavorBaijiu;high-throughput sequencing;fermented grains;microbial community diversity

TS261.6

0254-5071（2017）09-0030-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.007

2017-03-07

貴州省科學(xué)技術(shù)廳重大專(zhuān)項(xiàng)（黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字[2015]6012）；貴州省工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字（2011）3015）；貴州省科學(xué)技術(shù)廳重大專(zhuān)項(xiàng)（黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字[2012]601-5）

黃蘊(yùn)利（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)獒u香型白酒微生物。

*通訊作者：黃永光（1976-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)獒u香型白酒。