預糖化米酒發酵工藝研究

王星凱，謝 佳，何松貴，衛云路，吳 勝，吳振強*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528203）

預糖化米酒發酵工藝研究

王星凱1，謝 佳1，何松貴2，衛云路2，吳 勝1，吳振強1*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528203）

針對傳統米酒發酵工藝的創新升級以及大罐發酵的需求，對米酒發酵過程大米熟料與生料預糖化發酵等進行了深入探究。結果表明，原料經過蒸煮糖化后發酵，發酵醪還原糖含量升高至2倍左右，蒸餾液酒精度提升了10.62%，酒精度達到接近峰值的時間提前1～2 d，但是總酸、總酯含量都有所降低；熟料制漿糖化后酒精度進一步提高9.31%，總酯含量提高56.71%，但總酸略有降低；生料粉碎糖化酒精度進一步提升8.61%，但總酯含量相對減少21.47%。生料粉碎糖化發酵節省能源，發酵醪分散均勻、流動性好，在大罐發酵方面有著廣闊的應用前景。

米酒發酵；大米預糖化；生料；酒精度；酸酯

米酒發酵是以大米為原料，經過蒸煮、拌曲、發酵、蒸餾、陳化等工藝得到的有特殊風味的一種酒。米酒發酵過程的開始，首先就是原料中的生料淀粉向可被微生物直接利用的糖類物質轉化的過程，稱為原料的糖化[1]，一般由蒸煮糊化和一些微生物所分泌糖化酶的糖化作用二者共同完成的[2]。蒸煮可以使得生淀粉糊化，改變生料淀粉的結構，將生料淀粉轉化為小分子糖類。拌曲后，酒曲中的微生物（如霉菌等）分泌糖化酶等相關酶，對糊化后的淀粉進行消化，將其轉化為還原糖等可直接利用的糖類，被酵母菌、細菌等微生物所利用，從而繼續米酒的發酵過程[3]。糖化對微生物的生長、相關酶的活力、乙醇以及酸酯等風味物質的代謝起到了較為重要的影響[4]。可以說，糖化過程為米酒發酵奠定了基礎，控制生料淀粉的第一步轉化，對后面的發酵起到了重要的作用。

目前很多米酒廠家常用簡單蒸煮的方式糖化原料，除此之外還有諸如粉碎原料、高壓、焙炒等多種方式[2，5]來提高原料糖化程度，但是很多方法都存在糖化效率低、淀粉易老化、能耗高等缺點，也使得發酵過程中原料分布不均勻，原料利用度差。本研究針對原料的預糖化進行了一定的探索，研究了熟料酶法糖化、熟料制漿糖化、生料粉碎糖化的方法對發酵過程的影響，探索原料預處理新途徑，以期為米酒提高產量、縮短發酵周期快速發酵以及大罐發酵提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米碎、酒曲、糖化酶（800 U/g）：廣東省九江酒廠有限公司；氫氧化鈉、硫酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設備

TE612-L電子天平、PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；WFZUV-2802SH紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；TGL-16H臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；CX41顯微鏡：OLYMPUS；三支組酒精計（帶溫度計）：北京石景山玻璃儀器Ⅲ廠；HH-S型水浴鍋：礬義市予華儀器有限責任公司；DL-1型電子萬用爐：北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 米酒發酵工藝流程及操作要點

原料蒸煮→攤晾→拌曲→補水→發酵→蒸餾→米酒

操作要點：

原料蒸煮：在500 mL三角瓶中加入50.0 g米碎，倒入58.0 mL蒸餾水后，置于沸水中常壓蒸煮1 h，要求米料蒸煮完全，無夾生，不粘連[6-7]。

攤涼：蒸煮完成后，用玻璃棒將米飯攪拌、打散，利于拌曲，也便于好氧微生物的生長繁殖[8]。之后將三角瓶平放于桌面，使米料在瓶內鋪散開來，自然晾涼至30～40℃。

拌曲：將酒曲粉碎，準確稱量11.00 g酒曲粉并加入到三角瓶中，攪拌均勻，使酒曲粉和米碎充分混合。

補水：向拌好曲的三角瓶中加入65.0 mL 30℃的蒸餾水，使得料水比維持為50∶123（g∶mL），同時維持瓶內溫度不變化。

發酵：封住瓶口，并置于30℃恒溫培養箱中靜置培養。前發酵階段培養時間為5 d，完整發酵培養時間為15 d。

蒸餾：取出全部發酵醪液，加入200 mL水以及少量消泡劑，加熱進行蒸餾，取100 mL餾液，備用。

1.3.2 預糖化處理方法

熟料酶法糖化：米碎在蒸煮過后，將溫度控制在60～65℃范圍，加入65.0 mL 60℃蒸餾水，并轉移至60℃水浴鍋中，加入55 μL糖化酶，用封口膜封住瓶口，60℃恒溫水浴糖化2 h，期間每隔15～20 min用玻璃棒攪拌一次。糖化后，靜置冷卻至30℃，拌曲并進行發酵。

熟料制漿糖化：將50 g未蒸煮的米碎置于廣口瓶中，加入58 mL水，浸泡1 h。將其轉移至磨漿機中制漿，收集全部的米漿備用。將此米漿進行蒸煮、酶法糖化后，拌曲并進行發酵。

生料粉碎糖化：將米碎置于粉碎機中粉碎，過40目篩。之后，稱取50 g米碎粉末，向其中加入123 mL 30℃蒸餾水，取消蒸煮和攤涼的工藝，直接進行拌曲。最后向其中加入酶法預糖化所用酶量4倍的糖化酶，攪拌并封口，進行發酵。

1.3.3 檢測方法

（1）發酵醪還原糖含量分析

利用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[9]檢測醪液中還原糖的含量。

（2）蒸餾液指標分析[9]

酒精度：采用酒精計以及溫度計進行測定，根據測得的酒精度和相應溫度，查表《酒精濃度-溫度校正表》，校正成20℃條件下的酒精度。

總酸：用標準NaOH溶液滴定法進行測定，酒液總酸含量以乙酸計。

總酯：將酒液用標準NaOH溶液皂化后，用標準1/2H2SO4溶液反滴定的方法進行測定，總酯含量以乙酸乙酯計算。

2 結果與分析

2.1 熟料糖化發酵對發酵醪液還原糖和蒸餾液產酒的影響

在一個發酵周期內，對熟料常規發酵和熟料糖化發酵的發酵過程選取不同的發酵時間點進行取樣，檢測取得的發酵醪液中還原糖的含量和蒸餾液的酒精度，結果如圖1所示。

圖1 熟料糖化發酵對米酒酒精度(a)和還原糖含量(b)的影響Fig.1 Effect of saccharification fermentation of cooked rice on alcohol content(a)and reducing sugar content(b)of rice wine

由圖1可知，在發酵過程中，隨著發酵時間的延長，熟料糖化發酵和熟料常規發酵醪液酒精度均快速增加，發酵至5d后均趨于穩定，12d后均稍有下降；還原糖含量在發酵前5d均快速減少，至9 d之后基本趨于0，此后又稍有所上升。

由圖1可知，熟料糖化發酵與熟料常規發酵的快速產酒期均在2～5 d，之后便緩慢提升，常規發酵產酒在11 d時接近最大值，而糖化發酵產酒在9d已接近峰值，提前2 d左右，這表示糖化可以縮短發酵周期，在實際生產中具有重要意義。發酵后期（12 d后），糖化發酵與常規發酵產酒均有所降低，這可能是由于酯化作用以及呼吸作用消耗了乙醇[10-11]。

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發酵初期（1～2 d），熟料糖化發酵的還原糖含量為熟料常規發酵的兩倍左右，并從第2天開始，糖化發酵的還原糖含量開始急劇降低，這表明糖化發酵能顯著提升原料中初還原糖含量，使得微生物的發酵環境優于常規發酵，在經過短暫的高初還原糖濃度適應性抑制后，發酵微生物開始利用充足的還原糖快速產酒[11-12]。此外，對比圖1（b）中2～5 d時間段內兩條曲線的斜率可知，糖化發酵的還原糖消耗速率明顯高于常規發酵，與之對應的是在快速產酒期糖化發酵的產酒速率也要高于常規發酵，3 d時糖化發酵的酒精度便超過了常規發酵，并保持至整個發酵結束。

綜上可知，糖化提高了原料中淀粉向還原糖轉化的效率，提升了微生物的發酵狀態，從而提升了酒精的積累速度和總量。發酵完成后，熟料糖化發酵的酒精度達到峰值時間比熟料常規發酵提前2 d，酒精度也比常規發酵提升了10.62%。

2.2 熟料糖化發酵對酸酯代謝的影響

對熟料常規發酵和熟料糖化發酵的發酵過程中蒸餾液的總酸和總酯含量進行檢測，結果如圖2所示。

圖2 熟料糖化發酵對米酒總酸(a)和總酯(b)的影響Fig.2 Effect of saccharification fermentation of cooked rice on total acids(a)and total esters(b)of rice wine

由圖2（a）可知，熟料常規發酵的前3天總酸含量迅速增加，發酵3～15 d呈無規律波動；熟料糖化發酵的前3天，總酸含量也快速上升，之后稍有波動，漸趨穩定。發酵2～3 d時，兼氧發酵有利于微生物生長以及總酸的快速代謝，3 d后，大量微生物旺盛活動，進入厭氧發酵產酒階段，部分有機酸作為碳源及能源物質被消耗，以及醇酸發生酯化反應，總酸微量下降。

由圖2（b）可知，發酵產酯存在快速上升期和復雜波動期兩個時期。在發酵2～4 d時，微生物的產酸量要大于酯化減少的量，酸酯同步增加。發酵中期（7～12 d）酯化作用加強，酸的消耗量大于生成量，酸度下降[13]。隨后酯含量降低，可能是因為產酒速率增加，產酯微生物活性降低，產生的部分酯類被微生物代謝。

由圖2顯示，糖化發酵總酸水平較常規發酵低，但波動平緩，說明糖化不利于產酸細菌生長，但對發酵過程酸的穩定有一定的積極作用。高水平的有機酸對酵母酒精發酵會產生抑制[13]，這可能是糖化發酵總酸低導致產酒率高的原因之一。

與產酸類似，糖化發酵的產酯整體水平低于常規發酵，但在發酵1～4 d時糖化發酵總酯比常規發酵略高，說明糖化產生前期高糖濃度有利于產酯酵母和產酯霉菌的生長代謝。兩組發酵的變化趨勢基本類似，只是常規發酵在發酵前期沒有活躍期，在后發酵階段依舊不斷升高，原因可能為較高的酸度延緩了酯的水解作用[14-15]。

因此，預糖化發酵前期糖含量的升高對某些細菌的抑制作用是一直存在的，到后期無氧發酵開始時，這些細菌的菌體濃度無法繼續增加，故影響到了總酸和總酯的產生。

在熟料制漿糖化發酵和熟料常規糖化發酵的一個發酵周期內蒸餾液的酒精度進行檢測，結果如圖3所示。

圖3 熟料制漿糖化發酵對米酒酒精度的影響Fig.3 Effect of pulping saccharification fermentation of cooked rice on alcohol content of rice wine

由圖3可知，熟料制漿糖化發酵和熟料常規糖化發酵的酒精度變化趨勢是相似的，均呈現逐步穩定提升至最高值后在12 d處略微下降的趨勢。不同之處在于，在5 d之后，熟料常規糖化發酵的酒精度提升速率逐漸減緩，而熟料制漿糖化發酵的酒精度提升趨勢比熟料常規糖化發酵略高。熟料制漿糖化發酵可明顯提高米酒的酒精度，由熟料常規糖化發酵的酒精度由20.72%vol提高至22.65%vol，提升了9.31%。

2.4 熟料制漿糖化發酵對酸酯代謝的影響

在熟料制漿糖化發酵和熟料常規糖化發酵的一個發酵周期內蒸餾液的總酸和總酯含量進行檢測，結果如圖4所示。

圖4 熟料制漿糖化發酵對米酒總酸(a)和總酯(b)的影響Fig.4 Effect of pulping saccharification fermentation of cooked rice on total acids(a)and total esters(b)of rice wine

由圖4可知，熟料制漿糖化發酵對酸的積累沒有太大的影響，酒液中總酸的含量和熟料常規糖化發酵的變化趨勢沒有太大的差別。兩種預糖化處理的酒液總酯均呈升高、略微降低再升高的趨勢，熟料制漿糖化發酵的這個過程比熟料常規糖化發酵整體提前了1～2 d，且總酯含量的在發酵第16天時要比熟料糖化發酵高很多，發酵結束后酒液總酯由0.2116g/L提升至0.3316g/L，提升了56.71%。

熟料制漿糖化過后，米料可以更方便地被微生物所利用，前期微生物生長繁殖的時候，由于溶液中有較多溶解氧，所以產酒酵母和產酯酵母生長繁殖比較旺盛，而厭氧細菌則沒有得到更好的生長，從而使得總酸的含量變化不大，而酯的積累會有所增強。同時，由于微生物生長和醇類物質積累增多，也會有更多的底物向著酯的方向轉化，所以提高液化程度、提高反應面積之后，酯的積累得到了比較明顯的提升。

綜上可知，制漿糖化后原料糖化程度更高，反應接觸面積增大，各項生化反應都可以更早、更快、更好地進行，從而在一定程度上加速酒精積累，促進酸酯平衡，縮短發酵周期。

2.5 生料粉碎糖化發酵對產酒的影響

生料發酵取消了原料蒸煮的環節，可以節省蒸煮消耗的大量能源，然而未經蒸煮糊化的生淀粉很難被微生物所直接利用。對比生料常規發酵、生料糖化發酵、熟料常規發酵、熟料糖化發酵的酒精度，結果如圖5所示。由圖5可知，生料常規發酵出酒率明顯降低，酒精度低至3.53%vol，即使對生料進行糖化，酒精度也只達到7.68%vol，遠遠低于熟料常規發酵的酒精度（17.31%vol）和熟料糖化發酵的酒精度（21.87%vol），因此要想實現生料發酵，必須提高生料的預糖化效率，故對生料進行粉碎糖化。

圖5 不同原料預處理對米酒酒精度的影響Fig.5 Effects of different pretreatments of raw material on alcohol content of rice wine fermentation

在一個發酵周期內，對生料粉碎糖化發酵和熟料制漿糖化發酵的酒精度進行檢測，結果如圖6所示。

圖6 生料粉碎糖化發酵對米酒酒精度的影響Fig.6 Effect of crushing saccharification fermentation of uncooked rice on alcohol content of rice wine

由圖6可知，兩種預糖化發酵的酒精度變化規律相似，均呈現先快速提升后緩慢增加的趨勢。生料粉碎糖化發酵酒精度明顯提高，酒精度達到24.6%vol，比熟料制漿糖化發酵的酒精度22.65%vol提升了8.61%。

分析其原因，雖然米料沒有經過蒸煮，但是粉碎后，生料淀粉的細度達到40目水平，其顆粒大小已經遠遠小于米碎制漿蒸煮后的顆粒，使生物反應面積大大增加，促進反應的快速、高效進行。生料經過粉碎后，原料細密程度的增加使發酵醪黏度降低，促進傳質，米碎在分散系中比較均勻，流動性好，對乙醇的深層發酵起到了一定的促進作用，也有利于大批量發酵的進行。該結果肯定了生料粉碎糖化發酵的可行性。

2.6 生料粉碎糖化發酵對酸酯代謝的影響

在一個發酵周期內，對生料粉碎糖化發酵和熟料制漿糖化發酵蒸餾液的總酸和總酯含量進行檢測，結果如圖7所示。

圖7 生料粉碎糖化發酵對米酒總酸(a)和總酯(b)的影響Fig.7 Effect of crushing saccharification fermentation of uncooked rice on total acids(a)and total esters(b)of rice wine

由圖7可知，在酸的積累方面，生料粉碎糖化發酵一開始高于熟料制漿糖化，但隨著發酵的進行，總酸整體呈現波動下降的趨勢，而熟料制漿糖化發酵的總酸整體呈現逐步上升的趨勢，發酵12 d后高于生料粉碎糖化發酵，到發酵后期，二者含量相差不大；在酯的積累方面，兩種預處理總酯含量的變化趨勢依舊呈先升高再略微降低最后升高的趨勢，不同的是生料粉碎糖化發酵除前3天總酯含量較高外，整體含量低于熟料制漿糖化發酵，發酵結束時，生料粉碎糖化發酵的總酯只有0.26 g/L，相比熟料制漿糖化發酵減少21.47%。

分析其原因，可能為生料粉碎糖化發酵對原料的糖化過程，特別是生淀粉的糊化沒有太大的幫助，產酸細菌對生料淀粉的偏好也高于熟料淀粉，所以在發酵前期生料粉碎糖化發酵的總酸會異常偏高。隨著發酵的進行，這些酸會被微生物逐漸代謝掉，而酒中真正需要的酸得以保留下來。

綜上可知，生料粉碎糖化發酵進一步促進了發酵傳質，促進發酵的快速進行，提升了米酒的發酵速度和酒精度，有利于大罐發酵。但是生料粉碎糖化發酵也存在酸酯不平衡、總酯較低的問題。

3 結論

本研究在熟料常規發酵的基礎上添加糖化酶進行預糖化，酒精度提升了10.62%。將米碎制成米漿后再進行蒸煮糖化發酵，原料整體的液化水平更高，醪液的分散程度也更加均勻，酒精度進一步提升了9.31%。常規的生料發酵節約了能源，但是酒精度卻遠遠低于常規發酵的水平。采用生料粉碎糖化的發酵方法，促進發酵過程傳質，使得酒精度比制漿熟料發酵再提升了8.61%。預糖化發酵酒精度在發酵第9天左右就可達到最高值，有利于縮短周期。但糖化發酵對酸和酯的積累有著一定的負面作用，會在一定程度上影響酒的品質和口感，有必要用其他方法補救。生料粉碎糖化發酵可以節約能源，粉碎后米碎在分散系中比較均勻，流動性好，適合于大罐攪拌發酵。本研究結果為米酒發酵原料預處理工藝提供一定的科學依據，并為酒廠大罐發酵、提升產量和縮短周期提供思路和方法。

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Research on pre-saccharification and fermentation process of rice wine

WANG Xingkai1,XIE Jia1,HE Songgui2,WEI Yunlu2,WU Sheng1,WU Zhenqiang1*
(1.School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangdong 510006,China;2.Guangdong Jiujiang Distillery Co.,Ltd.,Foshan 528203,China)

Aiming at the innovation and upgrading of traditional rice wine fermentation process and the requirement of large tank fermentation,the pre-saccharification and fermentation of cooked and uncooked rice in fermentation process was investigated.The results showed that the raw material was fermented after cooking and saccharification,the reducing sugar content in the fermented mash increased to about 2 times,the alcohol content of distillate increased 10.62%,and the peak time of alcohol content was 1-2 d in advance.But the contents of total acids and total esters decreased.After cooked rice pulping saccharification,the alcohol content further increased 9.31%and totals esters content increased 56.71%,but total acids content decreased slightly.After uncooked rice crushing saccharification,the alcohol content further increased 8.61%,but total esters content decreased 21.47%relatively.Uncooked rice crushing saccharification could save energy,the fermented mash was dispersed evenly and good fluidity,and had a wide application prospects in the large tank fermentation.

rice wine fermentation;rice pre-saccharification;uncooked rice;alcohol content;acid ester

TS261.4

0254-5071（2017）09-0025-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.006

2017-04-15

廣東省公益研究與能力建設專項（2016A020210011）；廣東省江門市農業科技攻關計劃項目（20150160008347）；廣東省九江酒廠有限公司產學研合作基金（2016A0071011）

王星凱（1993-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程、酒類發酵。

*通訊作者：吳振強（1963-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、天然產物發酵生物轉化。