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微生物發酵產D-阿拉伯糖醇的研究進展

2017-10-24 07:45:18王曉丹李豆南雷安亮吳長貴邱樹毅
中國釀造 2017年9期
關鍵詞:優化研究

黃 魏,王曉丹,李豆南,雷安亮,吳長貴,邱樹毅*

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3.貴州珍酒釀酒有限責任公司,貴州 遵義 563003)

微生物發酵產D-阿拉伯糖醇的研究進展

黃 魏1,2,王曉丹1,2,李豆南1,2,雷安亮1,3,吳長貴1,3,邱樹毅1,2*

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3.貴州珍酒釀酒有限責任公司,貴州 遵義 563003)

D-阿拉伯糖醇作為一種功能性五碳糖醇廣泛應用于各個行業,文章對D-阿拉伯糖醇的微生物發酵法生產進行了綜述。對包括D-阿拉伯糖醇發酵菌株篩選、發酵工藝優化、微生物發酵底物利用及D-阿拉伯糖醇的分離純化等進行分析和深入探討,同時對今后低成本、綠色化生產D-阿拉伯糖醇的發展趨勢進行了展望。

D-阿拉伯糖醇;菌株篩選;研究進展

D-阿拉伯糖醇又稱為D-樹膠糖醇,其天然形式首次被FREREJACQUEM等[1]發現存在于蘑菇中,隨后LINDBERG B等[2]在地衣中也發現其存在,迄今為止,在自然界中以天然狀態存在的D-阿拉伯糖醇僅在這兩類物種中發現。D-阿拉伯糖醇與戊糖醇系列中的D-木糖醇、D-核糖醇互為同分異構體,標準狀態下為白色棱柱形結晶,味甜,易溶于水,12℃時以1∶48的比例溶于體積分數90%的乙醇溶液,不溶于乙醚,熔點103℃,旋光度130°。

在食品行業中,阿拉伯糖醇不僅作為高檔甜味劑,還可作為調制糖漿基質來改善酒精飲料品質并應用于相應食品加工生產過程中;在醫藥領域,D-阿拉伯糖醇可作為阿糖腺苷、阿糖胞苷和α-葡萄糖苷酶抑制劑等藥物的中間體,同時還可作為運輸介質以通過血腦屏障;而在化工方面,D-阿拉伯糖醇是顆粒性固體或親水涂層的促溶劑,可增強鋁電容器在高溫下的可靠性并提高電解質溶液的黏度,此外,還可作為合成高分子發泡材料的激活劑及顯影材料穩定劑;在生物方面,還能促進植物生長[3]。

自然界中存在的D-阿拉伯糖醇含量很少,直接提取所需原料的費用昂貴,不經濟且困難。用化學法也可得到D-阿拉伯糖醇,即通過D-阿拉伯糖、D-來蘇糖酸催化加氫得到D-阿拉伯糖醇[4],但化學合成法涉及的反應需要昂貴催化劑并在持續高溫下進行,生產周期長且污染嚴重,在一定程度上限制了生產規模的擴大。因此,國內外許多學者開始嘗試以生物轉化的方式來完成D-阿拉伯糖醇的生產并進行了大量研究。生物法具有綠色、環保的優勢,以活的微生物為細胞工廠,多種酶促反應生產D-阿拉伯糖醇,整個過程無需使用純糖底物和化學催化劑,具有大規?;a的運用潛力,在下游工程中該方法所得的產物更容易被分離除去,可有效提高D-阿拉伯糖醇的得率及純度。在此基礎上研究的熱點已轉向優產、高產D-阿拉伯糖醇菌株的發掘與生產工藝條件的優化,通過代謝途徑調整以及工業化生產模型的建立來進一步提高其生產效率,本文針對近年來阿拉伯糖醇這些研究熱點進行相應的總結,對D-阿拉伯糖醇今后研究發展方向進行展望。

1 不同發酵底物產D-阿拉伯糖醇代謝機理研究

1.1 葡萄糖代謝途徑

葡萄糖產D-阿拉伯糖醇有兩條途徑:第一步,該六碳糖被6-磷酸葡萄糖激酶磷酸化生成6-磷酸葡萄糖,經轉運進入磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP),然后轉化成D-核酮糖-5-磷酸,D-核酮糖-5-磷酸經核酮糖激酶催化脫去磷酸基生成D-核酮糖,再由D-阿拉伯糖醇脫氫酶降解D-核酮糖生成D-阿拉伯糖醇,此為D-核酮糖生成途徑。或者6-磷酸葡萄糖生成D-核酮糖-5-磷酸,D-核酮糖-5-磷酸經異構酶催化形成5-磷酸-D-木酮糖,再經D-阿拉伯糖醇脫氫酶降解D-木酮糖生成D-阿拉伯糖醇,此為D-木酮糖生成途徑[5]。

1.2 甘油代謝途徑

進入酵母細胞后,甘油的代謝分為磷酸化途徑和氧化途徑。對于磷酸化途徑,甘油通過簡單的擴散或主動運輸吸收進入細胞后,經甘油激酶磷酸化形成3-磷酸甘油,再由甘油-3-磷酸脫氫酶氧化生成磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate,DHAP),此為磷酸化途徑。在氧化途徑中,甘油經過甘油脫氫酶生成二羥基丙酮,然后再由二羥基丙酮激酶轉化成磷酸二羥丙酮。上一途徑生成的磷酸二羥丙酮被轉化成3-磷酸甘油醛,再經糖異生途徑生成6-磷酸葡萄糖進入磷酸戊糖途徑,遵循6-磷酸葡萄糖類似的途徑[6]。

2 生產D-阿拉伯糖醇菌株的研究

2.1 天然耐滲酵母

研究發現,能產D-阿拉伯糖醇的天然菌株大多屬于耐滲酵母和耐高滲酵母。早在1956年,SPENCER J F等[7]對蜂巢和花粉中分離得到的耐滲酵母進行培養,發現大部分菌能產如甘油、D-阿拉伯糖醇、甘露糖醇和赤蘚糖醇等多元醇,其產量受氮源及通氧速率的影響,為日后阿拉伯糖醇工業化生產菌株的發掘提供了重要指導。此后,諸如德巴利酵母屬[8]、梅奇酵母屬[9-10]、畢赤酵母屬[5,11]、漢遜酵母屬[12]、假絲酵母屬[13-15]、接合酵母屬[16-19]、克魯維酵母屬[20-25]、柯達酵母屬[26-27]等具有耐滲或耐高滲特性的酵母菌陸續被證實可用于D-阿拉伯糖醇的生產,表1給出了具有典型性的耐滲酵母產D-阿拉伯糖醇的總結。最新報道的種屬為白小燕等[28]于2017年報道的婁德酵母,相信今后仍然會不斷地有產D-阿拉伯糖醇的天然耐滲酵母的研究報道。

表1 產D-阿拉伯糖醇的耐滲酵母屬Table 1D-arabitol producing osmophilicSaccharomyces

2.2 其他天然種屬及產D-阿拉伯糖醇的工程菌株

能產D-阿拉伯糖醇的菌株大部分是天然耐滲酵母,但也有極少部分其他的天然種屬以及工程改造菌株也被報道能產生此多元醇,如RUIJTER G J等[29]研究米曲霉菌固態發酵時發現其菌絲體上含有包含D-阿拉伯糖醇脫氫酶在內的與對應多元醇累積相關性較高的高活性脫氫酶,由此證明該菌屬也具有生產D-阿拉伯糖醇的潛力。POVELAINEN M等[30]報道的一株代謝工程菌枯草芽孢桿菌ATCC31094,該菌能利用葡萄糖產生38%D-阿拉伯糖醇。另外,賀鵑等[31]將重組質粒pVgb-EX2轉化到產D-阿拉伯糖醇的酵母Saccharomycessp.X-62中并得到表達,使產量提高了27.3%。錢衛東等[32]采用基因工程技術,通過構建多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株,該菌株底物轉化率達51.2%。寧肖肖[12]運用低能離子束技術構建高產重組菌株,結合高通量篩選方法篩選出了一株產量為113.76 g/L的高產工程菌株,被命名為多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)DLg4-14。

3 發酵工藝的優化

許多研究者對培養基組成及發酵條件進行了優化,KORDOWSKA-WIATER M等[33]在他們的研究基礎上對優化的發酵參數進行了總結,即培養溫度為28~45℃,搖瓶和發酵罐中的轉速分別為125~250r/min和350~1000r/min;20~600 g/L葡萄糖,150~250 g/L甘油,乳糖濃度278~550 mmol/L;pH在3.6~7.0(主要為5.5~6.0),還有一些關于接種量的報道,一般2%~8%(一般為5%)為宜。這些研究旨在提高產物的濃度以及底物的轉化率,為以后的研究提供了可取經驗。

3.1 發酵培養基的優化

多年來,優良發酵培養基的選擇一直是工業化生產D-阿拉伯糖醇的重點環節,從發酵底物來看,絕大部分都是利用葡萄糖作為底物進行發酵,但近幾年有學者開始探究工業生產干酪乳清的廢料—乳糖作為底物發酵的可行性。另外,甘油作為生物柴油產業的副產物也成為了生產D-阿拉伯糖醇的熱門底物。從趨勢上看,發酵底物總體上正朝著低成本,綠色化的方向邁進。利用其他底物生產D-阿拉伯糖醇的研究見表2。

另一方面,針對其他發酵培養基成分的優化研究也廣泛地開展:孫文濤[35]采用響應面法對突變株D-阿拉伯糖醇發酵培養基進行優化,成功將季也蒙畢赤酵母突變株UD-3產量提高了44.3%。ZHU H Y等[27]針對Kodamaea ohmeri NH-9應用響應面中的中心組合設計(central composite design,CCD)對培養基組分進行了優化,得到優化的培養基組成為:D-葡萄糖200g/L,酵母膏4.24g/L,(NH4)2SO42.42g/L,CaCO315g/L,通過37℃、220r/min條件下發酵72h,獲得了(81.2±0.67)g/LD-阿拉伯糖醇。針對培養基組成的優化還包含某些特殊添加物,這些添加物或多或少能提高D-阿拉伯糖醇的產量,比如促進戊糖磷酸途徑(hexosemonophophate pathway,HMP)活性的特殊添加物[35]以及提高細胞滲透性的表面活性劑[36]。

3.2 發酵條件的優化

從研究手段來看,大部分研究者采用單因素和正交試驗進行優化,也有部分研究者運用響應面法進行優化試驗。從發酵方式看,采用階段性控溫、分批補料發酵等均有研究。但通過建立發酵模型,確定出準確的發酵參數,才能更為有效地契合今后該糖醇發展研究的趨勢。

唐曉芳等[37]采用正交試驗對Hansenula anomala轉化葡萄糖生產D-阿拉伯糖醇的反應條件進行研究后發現高供氧和高初始葡萄糖濃度有利于D-阿拉伯糖醇的積累,最終產量為245.97 g/L,轉化率為0.49 g/g葡萄糖。QI X等[18]在優化培養基的基礎上利用響應面法對魯氏酵母Z.rouxii JM-C46發酵產D-阿拉伯糖醇的發酵參數進行了優化,得出的優化參數如下:溫度30℃,pH 5.0,轉速220 r/min,接種量5%。在此優化條件下,培養96h得到的D-阿拉伯糖醇為77.05 g/L。張麗麗等[38]在對菌株Debaryomyces hansenii進行15 L發酵罐擴培時采用了分批補料發酵的方式,得到產量為125 g/L的D-阿拉伯糖醇。錢衛東等[39]采用調控發酵溫度的策略,首先在30~38℃培養18~24 h,然后40~49℃培養18~24 h,最后28~38℃培養74~96 h,最終得到了114.92 g/L產物。寧肖肖[12]則利用正交試驗確定了多形漢遜酵母DLg4-13最佳發酵條件后采用變溫策略,得到的D-阿拉伯糖醇產量為123.92 g/L,比恒溫發酵提高了3.73%。

4 D-阿拉伯糖醇的分離純化

從發酵液中獲得D-阿拉伯糖醇必須經過純化,因為在溶液中只有其純度超過65%時才會結晶[33]。HIROSHI O[40]發表了一種分離提取D-阿拉伯糖醇方法的專利:將發酵液中的菌體經過濾移除,所得濾液進行減壓濃縮,冷凍干燥以除去水分,然后用體積分數99%乙醇進行萃取,有機相繼續減壓濃縮,重結晶后得到產物。ALLOMAN A等[41]對利用甘油作為底物發酵生產阿拉伯糖醇的純化工藝進行了優化,提出了一種新式的阿拉伯糖醇結晶純化方法,即先用活性炭于30℃(pH=6)下完成雜質的初步分離,而后用丙酮選擇性地去除掉發酵液中的殘留甘油,最后于90℃采用體積分數為90%的丁醇溶液進行提純其后通過補加低溫丁醇溶液完成阿拉伯糖醇的重結晶,該方法的結晶率為66%,提取純度高達95%。針對D-阿拉伯糖醇的分離純化鮮有報道,JIANG M等[42]建立了分離L-阿拉伯糖醇的方法,取得了較好的分離效果,也可以作為今后D-阿拉伯糖醇分離純化工藝研究的重要借鑒,具體工藝為:發酵結束后離心移除菌體,上清液通過與活性炭于80℃振蕩的方法脫色,并用離子交換樹脂柱除去金屬離子,然后驗證電導率(<20 μS/cm),接下來通過濃縮調整L-阿拉伯糖醇的含量至70%,隨后從70℃至4℃緩慢冷卻,然后將懸浮在溶液中沉淀出的白色粉末狀的結晶離心分離,用體積分數為95%的乙醇溶液洗滌并干燥,得到約98%純度的L-阿拉伯糖醇。

5 總結

本文總結了目前已報道的產D-阿拉伯糖醇的天然菌株,在這些菌株中,目前報道產量最高的為Hansenula anomala,而梅奇酵母屬產量也十分可觀,在今后是否應該以這些高產糖醇的優良菌株為模式菌株,從基因工程的角度進行改良、馴化,以期得到能夠滿足大規模工業化生產的工程菌,成為今后D-阿拉伯糖醇研究的新方向,值得研究者們考慮。

在菌株的基礎上,進一步對高產D-阿拉伯糖醇的發酵工藝進行了綜述,發現培養基組成及含量隨菌株的要求而不同呈現多樣性的特征,其中,葡萄糖、木糖、木酮糖等均可作為發酵底物,但大部分研究顯示,葡萄糖更適于作為底物使用。再者,隨著低成本、綠色化要求的提出,近幾年針對廉價底物如乳糖及甘油的研究逐漸增多,這可能是今后培養基優化的新趨勢。底物代謝途徑的探究同樣是當今生物發酵行業的核心,對提高D-阿拉伯糖醇的產量有著重要的指導作用,目前,葡萄糖和甘油產D-阿拉伯糖醇的代謝途徑已經明了,但針對新型發酵底物乳糖代謝產該糖醇的代謝途徑仍不明確,今后需完善這方面理論知識。在發酵條件優化方面,大部分研究者采用單因素、正交及響應面法對發酵條件進行研究,但有研究者,如文中所述TOYODA T等[23-24]利用數學建模的方法,成功建立了數學模型,并取得了良好的效果,此類方法為今后系統、精確地研究液態發酵生產D-阿拉伯糖醇的體系提供了很好的借鑒。

除上述發酵工藝以外,發酵液中D-阿拉伯糖醇的分離純化一直是該領域的一個研究重點和難點,因此,今后可以將D-阿拉伯糖醇的分離純化作為研究的新起點。D-阿拉伯糖醇分離純化困難的原因是發酵產物組成復雜以及使用的培養基顏色較深等,研究可著重從這兩方面入手。雖然目前實驗室階段提取純度可達95%,但是在大批量生產的環境下是否仍能達到如此高的純度仍需進一步證實。無論如何,D-阿拉伯糖醇的工業化生產將一直是擺在研究者面前的重要課題,而進一步完善該物質的生產工藝,提高生產效率,都將建立在上述研究的基礎之上,相信在不遠的未來,隨著研究的深入,大規模高效生產D-阿拉伯糖醇將成為可能。

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Research progress of D-arabitol production by microbial fermentation

HUANG Wei1,2,WANG Xiaodan1,2,LI Dounan1,2,LEI Anliang1,3,WU Changgui1,3,QIU Shuyi1,2*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmaceutical,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Jane Wine Co.,Ltd.,Zunyi 563003,China)

D-arabitol,as a kind of functional sugar alcohol,is widely used in various industries.The production of D-arabitol by microbial fermentation was summarized,and the isolation and screening of strains,the optimization of fermentation process,the utilization of fermentation substrate,as well as the separation and purification of D-arabitol were analyzed and discussed.At the same time,the development trend of low-cost and green production of D-arabitol was prospected.

D-arabitol;strain screening;research progress

TS261.1

0254-5071(2017)09-0006-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.002

2017-06-23

貴州省科技支撐計劃項目(黔科合支撐[2016]2340);貴州省工業攻關項目(黔科合GZ字[2014]3012);貴州省重大專項項目(黔科合重大專項字[2015]6012)

黃 魏(1991-),女,碩士研究生,研究方向為發酵工程。

*通訊作者:邱樹毅(1963-),男,教授,博士,研究方向為應用生物技術。

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