葡萄糖調節蛋白78調控乙型肝炎相關性肝細胞癌患者線粒體生成蛋白的表達及臨床分析

李亞萍， 王 媛， 翟 嵩， 賈曉黎， 張 欣， 潘國英， 楊 穎

(西安交通大學第二附屬醫院 感染科， 西安 710004)

葡萄糖調節蛋白78調控乙型肝炎相關性肝細胞癌患者線粒體生成蛋白的表達及臨床分析

李亞萍， 王 媛， 翟 嵩， 賈曉黎， 張 欣， 潘國英， 楊 穎

(西安交通大學第二附屬醫院 感染科， 西安 710004)

目的研究葡萄糖調節蛋白78(GRP78)在乙型肝炎相關性肝細胞癌組織中的表達及其與患者臨床病理特征的關系，探索GRP78對肝癌細胞中線粒體生成相關蛋白分子的調控，為建立肝癌防治的新策略提供基礎。方法收集乙型肝炎相關性肝細胞癌54例患者組織標本，用免疫組化和Western Blot檢測肝癌及癌旁組織中GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ的表達；用siRNA干涉肝癌細胞中GRP78的表達，檢測細胞中GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ的表達；用實時定量PCR (qRT-PCR)檢測臨床標本和干涉GRP78 表達后肝癌細胞中線粒體DNA(mtDNA)的水平；對臨床資料和實驗數據進行統計分析。計量資料2組間比較比較采用t檢驗，計數資料2組間比較采用Fisher精確檢驗，患者生存分析采用Kaplan-Meier法。結果GRP78及Lon在乙型肝炎相關性肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(t值分別為9.135、5.523，P值均<0.001)，而線粒體生成相關蛋白TFAM、COXⅣ的表達及mtDNA水平顯著低于癌旁組織(t值分別為2.765、4.260、12.280，P值分別為0.011、<0.001、<0.001)。干涉肝癌細胞中GRP78的表達，可顯著提高線粒體生成相關蛋白TFAM、COXⅣ的表達及mtDNA水平(P值均<0.05)。GRP78在不同腫瘤數量、門靜脈癌栓以及腫瘤分期的病例中，表達水平存在顯著差異(P值分別為0.016、0.003、0.045)；GRP78低表達患者術后總生存期及無復發生存期優于GRP78高表達的患者(χ2值分別為5.006、4.995，P值分別為0.025、0.026)。結論GRP78對線粒體維持與生成具有潛在的調控作用，對建立潛在的肝癌防治新策略具有重要的臨床指導意義。

癌，肝細胞； 肝炎病毒, 乙型； 線粒體蛋白質類

全球癌癥統計報告[1]顯示，肝癌致死率位居癌癥第二位，其中又以肝細胞癌(HCC) 為主，占總病例數的70%～90%。在全球每年新增的肝癌病例和死亡病例中，我國約占50%[2]。HCC是多因素共同作用的結果，其中主要的風險因素包括HBV感染、肝硬化、應激刺激和基因異常表達等。HCC易轉移復發，預后極差，因此探索研究其發生發展機制具有重要的臨床價值及意義。內質網應激是腫瘤細胞適應微環境變化的一種普遍性自我防御反應，在維持腫瘤細胞的生存中扮演了極其關鍵的角色。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)是內質網應激發生的重要標志之一，參與腫瘤的發生發展及耐藥過程[3-5]。GRP78在正常肝組織中幾乎不表達[6]，在肝癌組織中表達程度各異且其作用的分子機制尚不明確，在乙型肝炎相關性肝細胞癌中的作用尚未見報道。本研究檢測了GRP78在乙型肝炎相關性肝細胞癌組織中的表達，并對其臨床特征進行了初步分析，探索了GRP78對線粒體生成相關蛋白的分子調控，為闡明HCC發生發展和防治的新策略提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 資料及試劑

1.1.1 一般資料 病例來源于2013年6月-2016年6月在本院接受肝癌切除手術的患者54例，均有石蠟和液氮凍存組織標本。病例選取依據：(1)經病理切片確診為HCC; (2)血清常規檢查HBsAg陽性；(3)手術前未進行過放化療；(4)臨床病歷及后續隨訪資料完整。癌旁組織選取依據：(1)距離癌灶組織≥2 cm；(2)經病理切片檢查未含癌細胞。本研究已獲得患者或家屬知情同意，并經本院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 兔抗人GRP78抗體(ab21685)、LON抗體(ab103809)、TFAM抗體(ab131607)、COXⅣ抗體(ab153709)、羊抗兔二抗(ab6721)均購自Abcam公司。兩步法EnVision免疫組化試劑盒和DAB試劑盒購自Dako公司。Lipofectamine 2000、PVDF膜購自Invitrogen公司；蛋白質預染Marker(SM 0671)購自Thermo Scientific公司；Opti-MEM、高糖DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco公司；基因組DNA提取試劑盒購自OMEGA BIO-TEK公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；GRP78 siRNA干涉引物5′-AUAACAUUUAGGCCAGCAAUAGUUC-3′和陰性對照引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUUU-3′由上海吉瑪公司設計合成；肝癌細胞系MHCC-97H、SMMC7721購自上海中科院細胞庫，肝癌細胞系BEL7402、HepG2和正常肝細胞HL-7702由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測HCC組織中GRP78蛋白的表達 免疫組化操作過程按照試劑盒說明書進行。石蠟標本制成厚度均為3 μm切片。用檸檬酸緩沖液高壓法進行抗原修復，兔抗人GRP78抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，生物素標記的羊抗兔二抗(1∶1000)，37 ℃孵育1 h，HRP標記的鏈霉親和素在濕盒中28 ℃孵育20 min，DAB顯色后蘇木精復染。陰性對照組用非免疫血清代替一抗。免疫組化評分標準：根據陽性細胞比率及顯色深淺綜合評分，最終得分用公式∑pi計算。p代表陽性細胞百分率分值，陽性細胞顯色百分數<10%分數為0；10%～25%為1；26%～50%為2；51%～75%為3；76%以上為4。i代表細胞顯色深淺：不顯色或顯色極淡為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。

1.2.2 Western Blot檢測蛋白的表達 取液氮凍存的HCC癌組織及癌旁組織各約100 mg，加入4 ℃預冷的組織裂解液和PMSF混合液(99∶1)，用勻漿器充分研磨，之后將勻漿組織移入EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。取4 μl上清液用BCA法測定其蛋白濃度，之后取部分上清液與還原型4×蛋白SDS-PAGE上樣緩沖液混合并煮沸10 min，之后用SDS-PAGE電泳分離，經Western Blot轉運至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，在膜上分別滴加兔抗人GRP78(1∶1000)、Lon(1∶2000)、TFAM(1∶1000)、COXⅣ (1∶2000)、β-actin抗體(1∶2000)等抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，之后將HRP標記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化學發光檢測試劑盒檢測蛋白表達情況，Gel Pro軟件分析灰度值。細胞中相關蛋白的表達檢測用全細胞裂解液，步驟同前。

1.2.3 細胞培養 所有肝癌細胞和正常肝細胞均以10%FBS的高糖DMEM培養基培養，細胞放置37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中正常培養；細胞用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代。

1.2.4 siRNA干涉 轉染前1天，將肝癌細胞和正常肝細胞按照每孔2×104個細胞接種于6孔板中，次日將400 pmol siRNA 用8 μl Lipofectamine 2000 轉染每孔細胞(終濃度為200 nmol/L)，實驗設置空白對照組、陰性對照組(Scramble siRNA)和實驗組(GRP78 siRNA)，每組設置3個復孔，重復3次實驗。48 h后提取細胞總DNA，72 h后裂解細胞，獲取細胞總蛋白。

1.2.5 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測HCC組織和細胞線粒體DNA(mtDNA)水平 取54例HCC組織和癌旁組織以及瞬時轉染GRP78 siRNA 48 h后的肝癌細胞及正常細胞，按照基因組DNA提取試劑盒步驟，提取全細胞DNA，并紫外定量。設計兩套PCR引物(表1)，分別擴增mtDNA和作為內參的核基因組中單拷貝的HGB基因。qRT-PCR反應體系為20 μl，包括1×SYBR Green PCR Master Mix、10 nmol/L引物、8 ng基因組DNA。擴增條件為94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環。所有樣品均設置3個復孔，每實驗批次均設置陽性對照和空白對照。實驗需滿足標準曲線，R2須大于0.99，重復樣品Ct值的標準差須小于0.25，否則重復該樣品實驗。

2 結果

2.1 GRP78在HCC和癌旁組織中的表達 本研究中用免疫組化檢測了54例HCC組織及癌旁組織GRP78的表達情況，與癌旁組織相比，46例HCC組織中GRP78表達較癌旁組織高，占85.2 %，8例HCC組織中GRP78表達較癌旁組織低，占14.8 %。免疫組化最終評分顯示，GRP78在HCC組織(7.481±0.294)和癌旁組織(4.322±0.291)中的表達差異具有統計學意義(t=7.626,P<0.001)(圖1)。

圖1 GRP78在HCC組織及癌旁組織中的免疫組化染色結果

2.2 GRP78在HCC組織中的表達水平與臨床特征

分析患者臨床特征發現，GRP78在腫瘤單發或多發、是否存在門靜脈癌栓以及不同腫瘤分期的乙型肝炎相關性肝細胞癌病例中，表達水平的差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。Kaplan-Meier生存分析顯示，GRP78低表達患者術后總生存期及無復發生存期優于GRP78高表達的患者(χ2值分別為5.006、4.995，P值分別為0.025、0.026)(圖2)。

2.3 GRP78與線粒體生成相關蛋白在HCC中的表達 GRP78是內質網應激的標志分子，本研究隨機選取了12例HCC組織及其癌旁組織，用Western Blot法檢測了組織中GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ等內質網應激和線粒體生成相關蛋白的表達情況(圖3)，用Gel Pro軟件測量其灰度值，進行半定量分析(表3)。結果顯示，GRP78、Lon蛋白在癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，TFAM、COXⅣ的表達則顯著低于癌旁組織，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

表1 用于mtDNA qRT-PCR的引物序列

表2 HCC患者臨床特征與GRP78表達水平情況(例)

圖2 GRP78表達水平與HCC患者術后總生存和無復發生存的關系

圖3 Western Blot檢測GRP78和線粒體生成相關蛋白在HCC中的表達

2.4 HCC和癌旁組織中mtDNA水平分析 本研究提取了54例HCC組織和癌旁組織中的基因組DNA和mtDNA，用qRT-PCR檢測組織中mtDNA水平。結果顯示，54例HCC組織中mtDNA水平(0.266±0.016)顯著低于癌旁組織(0.677±0.029)(t=12.280，P<0.001)。

2.5 干涉肝癌細胞中的GRP78表達后線粒體生成蛋白和mtDNA水平分析 GRP78 siRNA轉染肝癌細胞MHCC-97H、SMMC7721、BEL7402、HepG2和正常肝細胞HL-7702后，Western Blot檢測結果顯示，與陰性對照組相比，GRP78和Lon在肝癌細胞中表達顯著降低(tGRP78值分別為191.300、59.570、311.000、84.940，tLon值分別為115.300、15.800、236.800、97.800，P值均<0.05)，而TFAM、COXⅣ表達水平顯著增高(tTFAM值分別為25.260、25.330、10.310、11.410，tCOXⅣ值分別為125.900、73.570、126.400、84.940，P值均<0.05)；而在正常肝細胞中，GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ與陰性對照組無顯著差異(P值均>0.05) (圖4)。mtDNA qRT-PCR檢測結果顯示，干涉GRP78后，與陰性對照組相比，mtDNA水平顯著升高(P值均<0.05)，而正常肝細胞差異無統計學意義(P>0.05) (表4)。

表4 干涉肝癌細胞和正常肝細胞中GRP78表達后mtDNA水平分析

圖4干涉肝癌細胞和正常肝細胞中GRP78表達后線粒體生成相關蛋白的表達情況*P<0.05

3 討論

目前HCC的主要治療手段包括手術切除、介入、射頻消融等，早診斷早治療對提高患者生存率具有非常重要的作用，充分利用臨床標本研究HCC潛在診治靶點和預后指標及其分子機制具有重要意義。內質網應激現象在腫瘤細胞中普遍存在[7]，以應對缺氧、氧化應激、營養匱乏以及鈣離子穩態失衡和生存微環境的變化。GRP78表達升高被看作是內質網應激發生的重要標志之一，其參與了腫瘤的發生發展及耐藥過程，與以往在肝癌組織中的研究[8-9]基本一致。本研究結果顯示，GRP78在乙型肝炎相關肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。但是與以往研究不同的是[6]，GRP78在癌旁組織中表達也有所增高而非不表達，這可能與癌旁組織應對微環境改變，產生內質網應激有關。

HBV感染是引起肝細胞內質網應激的刺激因子之一，也是HCC發生發展的重要危險因素[10]。以往的細胞生物學研究[11-13]表明，HBV感染可以引起肝癌細胞中GRP78表達升高，進而引起肝癌細胞的凋亡、免疫逃逸、放化療耐受，但其作用的分子機制尚不明確。本研究發現，在腫瘤是否多發、門靜脈是否有癌栓和不同腫瘤分期的HCC組織中，GRP78的表達水平具有顯著差異。同時發現，GRP78低表達的患者術后總生存率和無復發生存率優于GRP78高表達的患者，提示GRP78蛋白表達水平對判斷乙型肝炎相關性肝癌的臨床預后具有重要臨床價值。

mtDNA的突變、拷貝數以及水平的變化與腫瘤的發生發展、腫瘤風險、腫瘤耐藥性密切相關[14-16]，文獻[17]報道內質網應激介導了腫瘤中線粒體的凋亡。因此，本研究檢測了HCC組織中線粒體相關蛋白的表達及mtDNA水平。結果發現，除了GRP78表達升高外，線粒體內關鍵的蛋白水解酶Lon也顯著高于癌旁組織。Lon蛋白酶是一種存在于線粒體中的ATP依賴蛋白酶，可以選擇性地降解TFAM，對保護線粒體、維持線粒體再生起著重要作用[18-20]。與此同時，線粒體生成標志分子COXⅣ、mtDNA合成的核心轉錄因子TFAM和mtDNA水平則顯著低于癌旁組織。之后，課題組者通過細胞生物學實驗發現，干涉肝癌細胞中GRP78的表達，蛋白水解酶Lon的表達水平也顯著下降，而肝癌細胞中mtDNA水平及線粒體生成相關蛋白TFAM、COXⅣ的表達則顯著提高，呈一種逆轉現象。這些結果提示，在腫瘤微環境中，GRP78蛋白可能通過Lon和TFAM對線粒體維持與生成、mtDNA的水平產生潛在的調控作用，是潛在的干預靶點，這為進一步探索HCC發生發展及耐藥機制提供了線索，對建立潛在的HCC防治新策略具有一定的臨床指導意義。

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Glucose-regulatedprotein78regulatestheexpressionofmitochondrialgenesisproteinsinHBV-relatedhepatocellularcarcinomaaclinicalanalysis

LIYaping,WANGYuan,ZHAISong,etal.

(DepartmentofInfectiousDiseases,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

ObjectiveTo investigate the expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78) in HBV-related hepatocellular carcinoma (HBV-HCC) and its association with clinicopathological features, as well as its regulatory effect on mitochondrial genesis proteins in hepatoma cells, and to provide a basis for new strategies for the prevention and treatment of HCC.MethodsTissue samples were collected from 54 patients with HBV-HCC, and immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression of GRP78, Lon, TFAM, and cytochrome C oxidase Ⅳ (COXⅣ). The expression of GRP78 in hepatoma cells was interfered by siRNA, and then the expression of GRP78, Lon, mitochondrial transcription factor A (TFAM), and COX Ⅳ was measured. Quantitative real-time PCR was used to measure the level of mitochondrial DNA (mtDNA) in clinical specimens and HCC cells after GRP78 expression was interfered with. A statistical analysis was performed for clinical and experimental data. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups, the Fisher′s exact test was used for comparison of categorical data between groups, and the Kaplan-Meier method was used for survival analysis.ResultsCompared with the adjacent tissues, HBV-HCC tissues had significantly higher expression of GRP78 and Lon (t=9.135 and 5.523, bothP<0.0001) and significantly lower expression of the mitochondrial genesis proteins TFAM and COX Ⅳ and mtDNA level (t=2.765, 4.260, and 12.280,P=0.011, <0.001, and <0.001). There were significant increases in the expression of the mitochondrial genesis proteins TFAM and COX Ⅳ and mtDNA level after the interference with GRP78 expression in hepatoma cells (allP<0.05). There were significant differences in the expression of GRP78 between patients with different numbers of tumors, patients with and without portal vein tumor thrombus, and patients with different tumor stages (P=0.016， 0.003, and 0.045). The patients with low GRP78 expression had significantly longer overall survival and recurrence-free survival after surgery than those with high GRP78 expression (χ2=5.006 and 4.995，P=0.025 and 0.026).ConclusionGRP78 has a potential regulatory effect on mitochondrial genesis and maintenance and has important clinical guiding significance in establishing new strategies for the prevention and treatment of HCC.

carcinoma, hepatocellular； hepatitis B virus； mitochondrial proteins

R512.62； R735.7

A

1001-5256(2017)10-1949-06

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.10.020

2017-05-09；

2017-06-15。

國家自然科學基金資助(81500453)

李亞萍(1986-)，女，助理研究員，博士，主要從事感染性疾病的防治研究。

翟嵩，電子信箱：zhaisongsong@189.cn。

引證本文：LI YP, WANG Y, ZHAI S, et al. Glucose-regulated protein 78 regulates the expression of mitochondrial genesis proteins in HBV-related hepatocellular carcinoma: a clinical analysis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(10): 1949-1954. (in Chinese)

李亞萍， 王媛， 翟嵩， 等. 葡萄糖調節蛋白78調控乙型肝炎相關性肝細胞癌患者線粒體生成蛋白的表達及臨床分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(10): 1949-1954.

(本文編輯：朱 晶)