含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒預防肝細胞癌術后復發的療效分析

孟 健， 杜松濤， 張勁光

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院， 北京 100069)

論著/肝臟腫瘤

含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒預防肝細胞癌術后復發的療效分析

孟 健， 杜松濤， 張勁光

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院， 北京 100069)

目的觀察外科手術聯合基因治療對預防肝細胞癌(HCC)術后復發的療效。方法選取2006年7月-2013年2月首都醫科大學附屬北京佑安醫院收治的102例單發HCC患者(腫瘤分期TNM1～2期,腫瘤直徑<10 cm), 對其中60例患者在手術前后聯合含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒(ADV-TK)基因治療(基因組)，42例患者采用單純手術切除(手術組)，對患者術后復發情況進行定期隨訪。2組患者的臨床資料比較采用t檢驗(計數資料)和χ2檢驗(計量資料)；采用log-rank檢驗分析2組患者的累積復發率，采用單因素和多因素Cox回歸分析對患者復發率有顯著影響的因素。結果基因組1、3、5年的腫瘤復發率為13.8%、33.7%和47.7%, 手術組為18.5%、53.2%和69.2%,2組累積復發率比較，差異有統計學意義(χ2=2.643,P=0.041)。除術后基因組發熱患者顯著多于手術組外，2組并發癥發生率以及住院時間無明顯差別。多因素分析顯示，基因治療是腫瘤累積復發率的獨立影響因素(比值比=2.752,95%可信區間：1.164～4.251,P=0.038)。結論在手術切除的基礎上聯合基因治療，可以有效減少術后腫瘤復發，值得臨床推廣。

癌, 肝細胞； 基因療法； 復發

隨著肝膽外科技術的發展，大部分肝細胞癌(HCC)患者都能獲得手術切除的機會，但術后腫瘤復發率居高不下，成為困擾肝膽外科醫生的重要難題之一。基因治療是近幾年來在國際發展起來的一種有別于傳統治療的非常規方法，通過不同的基因載體將病毒整合于腫瘤細胞中，引發某種基因改變使腫瘤細胞自行凋亡或者提高對特定藥物的敏感性，為一些難治性腫瘤提供了一種新的思路，這種方法在婦科及胃腸腫瘤的治療中已經得到了廣泛應用并觀察到了較好的效果[1]，但其在肝癌的臨床應用中尚缺少相關的臨床數據和資料。為了觀察基因治療對預防肝癌術后復發的影響及長期療效，解決術后肝癌復發的難題，為提高目前國內肝癌外科治療水平提供新的思路，本院在2000年開始對裸鼠體內肝癌和體外肝癌細胞進行了基因治療，結果發現其能有效的抑制腫瘤細胞生長，未觀察到明顯毒副作用[2]。在此基礎上，進一步采用含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒(ADV-TK)基因對HCC患者進行了試驗性治療，觀察了術后復發率，現報告如下。

1 資料與方法

1．1 研究對象 選取2006年7月-2013年2月在本院肝膽外科治療的HCC患者。納入標準：(1)年齡40～60歲(肝癌多人群，有代表性)；(2)術前經臨床影像學診斷單發腫瘤直徑<10 cm，無明確淋巴結及遠處轉移，TNM分期1～2期(無肝內大血管侵犯)；(3)手術完整切除腫瘤，術后病理診斷為HCC，病理切緣距腫瘤>2 cm。排除標準:(1)術前已有介入或者其他腫瘤治療史；(2)服用免疫抑制劑或者其他影響免疫功能藥物的患者；(3)術中或術后出現嚴重并發癥在1個月內死亡；(4)嚴重肝硬化，肝功能Child-Pugh分級B～C級；(5)嚴重脾功能亢進，PLT<5.0×109/L；(6)有其他臟器的功能不全以及對更昔洛韋過敏等不適合進行基因治療的患者。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有參加試驗的患者均簽屬了知情同意書。

1.2 研究方法和分組標準 共有102例患者參加了試驗，在治療前將基因治療的方法、費用及可能產生的副作用向患者及家屬講明，然后根據自愿的原則由患者自主選擇分組和治療的方法。在術前符合研究要求的患者中，有60例患者采用了基因+手術治療(基因組)，其他42例患者采用單純的手術切除(手術組)。

1.3 基因治療方法 基因組患者分別進行至少3次或者多次基因注射。注射用基因為ADV-TK(濃度5×1012/ml)，共分3次(或者多次)進行注射。第1次于術前在B超引導下通過穿刺針經皮注射，3～4 ml/次，以生理鹽水100 ml稀釋后使用，注射于腫瘤中心及四周；第2次在術中注射于肝斷面、隔肌、腎包膜、后腹膜及胃網膜血管，2～3 ml/次，以生理鹽水100 ml稀釋后使用；第3次在術后2周通過介入方法，經導管于肝動脈內注射基因2～3 ml(根據情況可多次注射，每次間隔1～2個月)。每次基因治療后常規靜脈滴注更昔洛韋，0.25 g/次，2次/d，持續2周。術后根據患者情況，可通過介入進行多次局部或者全身治療。

1.4 觀察指標 術后每月對患者隨訪1次，隨訪內容包括AFP、肝功能、B超，如有可疑，即行CT或者MRI檢查以明確診斷，必要時對患者行PET-CT或者肝穿刺檢查，隨訪終點為腫瘤復發或者死亡。復發定義為術后CT或MRI檢查見肝內肝外再次出現HCC或者AFP明顯升高。觀察指標包括術前腫瘤大小、肝功能、AFP、異常凝血酶原[維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導的蛋白質 (protein induced by vitamine K absence or antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ)]、術后病理結果(分化程度)、術后1個月內并發癥及住院天數，主要觀察指標為腫瘤累積復發率以及對其有顯著影響的因素。

2 結果

2.1 一般資料 在參加試驗的102例患者中，最終有92例患者完成了試驗(基因組54例，手術組38例)，10例患者未完成基因治療療程或者術后無法進行定期隨訪確定腫瘤復發時間。術前2組患者的腫瘤大小、肝功能、PLT以及腫瘤標志物、PIVKA-Ⅱ比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。基因組54例患者中，有28例進行了局部切除，17例進行了1個肝段的切除,9例進行了2個肝段及以上的切除；術后病理結果6例為高分化癌，其余48例患者為中-低分化癌。手術組38例患者中，19例進行了局部切除，11例進行了1個肝段切除，8例進行了2個肝段及以上的切除；術后病理結果7例為高分化癌，其余31例為中-低分化癌。2組術后并發癥比較，除發熱基因組高于手術組外，余下差異均無統計學意義。2組住院時間無明顯差異。術后病理切緣及患者術后1個月復查CT結果均未發現有腫瘤殘余或者復發。基因治療后，約88%的患者通過大體標本及病理證實腫瘤壞死明顯，并形成完整包膜(圖1a～c)，而手術組僅有34%的患者有自然形成的包膜，二者相差明顯(χ2=3.12，P<0.05)。

表1 2組患者的臨床資料比較

圖1基因組術前MRI及術后病理標本a：術前在治療后可見腫瘤與肝組織間有低信號帶；b:腫瘤包膜完整，中心有大量壞死細胞；c：包膜由纖維及部分凝固性壞死細胞組成(箭頭所示)， T示腫瘤， H示正常肝細胞

2.2 臨床預后 基因組平均隨訪時間為(3.9±1.2)年，手術組為(3.7±1.1)年。基因組中腫瘤復發26例，手術組腫瘤復發25例。基因組1、3、5年腫瘤復發率分別為13.8%、33.7%和47.7%；手術組為18.5%、53.2%和69.2%，2組累積復發率比較，差異有統計學意義(χ2=2.643,P=0.041)(圖2)。多數腫瘤復發部位在原腫瘤附近，或者肝內其他部位出現新的增強結節。另有2例患者出現肺轉移，2例患者為肝門及后腹膜淋巴結轉移。

圖2 2組患者累積復發率比較

變量單因素分析(P值)多因素分析βP值比值比95%可信區間男/女0．5730．2630．310年齡(歲)(>60vs≤60)0．4830．2010．651基礎肝病(乙型肝炎vs丙型肝炎)0．7590．1750．397基因治療(是vs否)0．0311．1740．0382．7521．164～4．251肝硬化(是vs否)0．1730．4210．205TBil(μmol/L)(>34．2vs≤34．2)0．3920．3180．301PLT(109/L)(>100vs≤100)0．8690．1920．562PTA(%)(>80vs≤80)0．5640．1730．591AFP(ng/ml)(>7vs≤7)0．0290．4180．152PIVKA-Ⅱ(mAU/ml)(>40vs≤40)0．0210．3210．126腫瘤大小(cm)(>2vs≤2)0．1750．2850．375

2.3 與腫瘤累積復發率相關的影響因素分析 單因素分析結果顯示，AFP、PIVKA-Ⅱ和基因治療與腫瘤累積復發率相關；多因素分析結果顯示，基因治療是腫瘤累積復發率的獨立影響因素(表2)。

3 討論

對于可切除的HCC患者，腫瘤復發仍是影響預后的重要因素。研究[3]發現HCC在肝內擴散以及局部的微轉移是術后復發的主要原因之一，此外手術過程對肝組織的擠壓和推動也加速了腫瘤的轉移。所以多數醫院在術后采用藥物、介入及放療等方法，防止腫瘤復發。但肝癌一般惡性程度相對較高，對藥物敏感性較差，故效果均不明顯。因此目前迫切需要一種新的輔助方法防止腫瘤在術后擴散。

根據最新國際研究成果以及本院的前期臨床試驗，在對肝癌和晚期口腔腫瘤治療的體外試驗中，基因治療具有良好的療效[4]。試驗中采用的是整合了自殺基因的重組腺病毒，其中病毒作為載體將胸苷激酶基因傳入腫瘤細胞，磷酸化并納入到新生的DNA鏈中，其編碼產生鳥苷化合物(胸苷激酶)，可以將無毒性藥物前體更昔洛韋轉化為細胞毒性藥物，從而使腫瘤細胞產生調亡。病毒對代謝和分裂活躍的細胞感染率較高[5]，而對正常細胞作用較少，因而可以有效的消滅殘留的腫瘤細胞。通過病理檢查還發現在基因治療后，腫瘤組織局部會出現明顯的炎癥反應，伴有T、B淋巴細胞、巨細胞浸潤，纖維組織增生，腫瘤體積縮小并形成完整的包膜，這樣減少了腫瘤復發和擴散的機率[6]。所以這是一種新的治療思路，比傳統方式適用性和可重復性高，同時無其他毒副作用，對于肝功能較差的患者同樣適用。因此筆者在上述研究的基礎上將其用于HCC的臨床治療，發現基因治療同傳統治療方法相比，患者的無瘤生存率明顯提高，說明基因治療可以延緩和減少腫瘤的復發。通過單因素分析發現與腫瘤累積復發率有關的因子包括AFP、PIVKA-Ⅱ和基因治療，在多因素分析中獨立影響因素僅為基因治療。這是因為前2個指標主要反映了腫瘤的惡性程度，AFP及PIVKA-Ⅱ高的患者腫瘤惡性程度高，易復發，這一點已經在臨床得到證實，而后一項主要反映了治療因素，所以在單因素分析中也與腫瘤復發相關；在多因素治療中排除了前二者，是因為基因治療可以有效的解決惡性程度較高的腫瘤高復發的問題，是與腫瘤復發相關性最強的因素。基因治療之所以較傳統方法療效更好，除了能夠直接抑制腫瘤轉移和生長外，還可以通過旁觀者效應，使附近腫瘤以及部分正常細胞死亡，與正常肝組織間形成一道纖維屏障，阻止腫瘤細胞向臨近播散和內外血管交匯[7],這在本研究術前影像及術后病理中也得到了證實。所以在術前采用基因治療，就可以有效防止在手術過程中擠壓腫瘤所發生的肝內擴散，反復多次治療可以為再次切除或者射頻治療創造條件。而且這種方法基本無毒副作用，對肝功能不產生損傷，可以通過反復多次使用，達到更好的效果，這一點更是目前其他療法不具備的。

通過多年的臨床試驗發現，臨床療效與基因治療的腫瘤轉染率密切相關，這就需要注意以下幾個問題。首先是腫瘤體積對治療的完全性影響較大，這是因為盡管ADV-TK可以通過旁觀者效應使臨近的腫瘤細胞死亡，但由于腺病毒滲透能力過低，一般來說只有表層及臨近的細胞受到轉染，而壞死的細胞對內部腫瘤細胞的進一步感染有一定防護作用，這樣僅從外圍注射難以到達腫瘤內部[8]，因此需要多點的內部注射，而對于10 cm以及更大的腫瘤，多點注射轉染率也會受到明顯影響，甚至大部分腫瘤細胞都無法轉染，則難以達到治療目的，這也是此次試驗主要針對10 cm以上肝癌患者的主要原因。此外轉染的途徑和次數對于轉染率也有一定的影響，如果采用傳統的全身注射的方式，腺病毒濃度較低，且易被免疫系統破壞，所以為了提高轉染率，采用了多次和局部給藥的方式，所有患者給藥3次或者以上。同時筆者認為作為一種仍處于試驗階段的方法[9]，還有下列問題需要進一步研究，主要包括探討新的載體及其轉染方式，使基因轉染量增加，以及針對個體的基因化精準應用，制訂標準化的基因治療方案和療效評估標準。

基因治療具有安全、創傷小等優點，在肝癌患者的手術治療過程中，肝切除聯合基因治療可以在清除腫瘤的同時，防止術后復發和轉移，提高患者的生存期，是一種值得推廣的新的治療方法。

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Clinicaleffectofrecombinantadenoviruscontainingthymidinekinasesuicidegeneinpreventingpostoperativerecurrenceofhepatocellularcarcinoma

MENGJian,DUSongtao,ZHANGJinguang.

(BeijingYouAnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the clinical effect of surgical operation combined with gene therapy in preventing postoperative recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsA total of 102 patients with single HCC (TNM stage 1-2, tumor diameter <10 cm) who were admitted to Beijing YouAn Hospital, Capital Medical University, from July 2006 to February 2013 were enrolled, and among these patients, 60 underwent the gene therapy with recombinant adenovirus containing thymidine kinase suicide gene (ADV-TK) before and after surgery (gene group) and 42 underwent surgical resection alone (surgery group). The patients were followed up regularly after surgery to observe postoperative recurrence. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups, and the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. The log-rank test was used for the analysis of cumulative recurrence rate, and univariate and multivariate Cox regression analyses were used to identify influencing factors for recurrence rate.ResultsThe 1-, 3-, and 5-year recurrence rates of tumor were 13.8%, 33.7%, and 47.7% in the gene group and 18.5%, 53.2%, and 69.2% in the surgery group, and there was a significant difference between the two groups (χ2=2.643,P=0.041). The gene group had a significantly higher proportion of patients with pyrexia after surgery than the surgery group, and there were no significant differences in the incidence rates of other complications and length of hospital stay between the two groups. The multivariate analysis showed that gene therapy was an independent influencing factor for cumulative rumulative recurrence rate (odds ratio=2.752,95 confidence interval:1.164-4.251,P=0.038).ConclusionGene therapy combined with surgical resection can effectively reduce postoperative recurrence of tumor, and therefore, it holds promise for clinical application.

carcinoma, hepatocellular； gene therapy； recurrence

R735.7

A

1001-5256(2017)10-1944-05

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.10.019

2017-04-25；

2017-06-13。

孟健(1972-)，男，副主任醫師，主要從事肝癌治療和肝移植免疫方面的研究。

張勁光， 電子信箱：3522428451@qq.com。

引證本文：MENG J, DU ST, ZHANG JG. Clinical effect of recombinant adenovirus containing thymidine kinase suicide gene in preventing postoperative recurrence of hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(10): 1944-1948. (in Chinese)

孟健， 杜松濤， 張勁光. 含胸苷激酶自殺基因的重組腺病毒預防肝細胞癌術后復發的療效分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(10): 1944-1948.

(本文編輯：朱 晶)