A型肉毒毒素對人瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡影響的實驗研究

楊艷清++張潔++許其軍++吳希晞++黃燕++高揚++江昌艷

[摘要]目的：探討A型肉毒毒素對人瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響。方法：體外分離和培養人瘢痕疙瘩成纖維細胞，實驗組在細胞培養過程中加入A型肉毒毒素（稀釋成5U/0.1ml）進行干擾，空白對照組培養液中不加A型肉毒毒素。培養72h后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT]法顯示A型肉毒毒素作用后細胞增殖速度變慢；流式細胞儀檢測顯示實驗組早期凋亡和晚期凋亡的細胞數量較空白對照組均明顯增多，成纖維細胞凋亡率差異有統計學意義（P<0.05）。結論：A型肉毒毒素可以抑制瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞的增殖活性，誘導成纖維細胞的凋亡。

[關鍵詞]A型肉毒毒素；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；細胞增殖；凋亡

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）09-0043-03

Effects of Botulinum Toxin Type A on Apoptosis of Human Keloid Fibroblast

YANG Yan-qing，ZHANG Jie，XU Qi-jun，WU Xi-xi，HUANG Yan，GAO Yang， JIANG Chang-yan

（Department of Plastic Surgery， Tongren Hospital of Wuhan University，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective To investigate the effects of botulinum toxin type A （BTXA） on apoptosis of human keloid fibroblast. Methods Human keloid fibroblast was isolated and cultured in vitro， the medium containing BTXA（diluted concentration of 5U/0.1ml）was used to intervene the cell growth in experience group， BTXA was not added in blank control group. At 72 hours after cells were cultured， cells apoptosis were measured by flow cytometry（ FCM ）. Results Cells proliferation rate was slow with MTT method. The cell numbers of early and late apoptosis in experience group were significantly more than those of early and late apoptosis in blank control group with FCM， showing a significant difference between them（P<0.05）. Conclusion BTXA can inhibit the proliferation and induce apoptosis of human keloid fibroblast.

Key words： botulinum toxin type A； keloid； fibroblast； cell proliferation； apoptosis

瘢痕疙瘩屬于整形外科難治性疾病之一，對于較局限性的瘢痕疙瘩，瘢痕內藥物注射是主要的治療方法，目前最常用的藥物是激素類藥物，但是注射后，可能發生不易被患者接受的不良反應[1-2]。近年來，有研究表明A型肉毒毒素可治療和預防瘢痕疙瘩[3-6]，但作用機制還不是十分清楚[7-8]。筆者在體外培養人瘢痕疙瘩成纖維細胞的基礎上，研究了A型肉毒毒素對成纖維細胞凋亡的影響，以進一步探索其治療瘢痕疙瘩的作用機制。

1 臨床資料

收集2015年6月-2016年12月在筆者科室行上臂瘢痕疙瘩切除的患者組織標本29例，均為男性，年齡18～36歲，平均28.16歲。取材前6個月沒有藥物治療史，標本的獲取征得患者本人同意。使用材料：A型肉毒毒素（衡力；蘭州生物制品研究所）。

2 方法

2.1 人瘢痕疙瘩成纖維細胞的分離和培養：手術臺獲取29例患者上臂瘢痕疙瘩組織標本，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）反復浸泡沖洗，加入1ml 0.25%胰酶，4℃過夜。次日分離表皮和真皮，將組織塊剪碎成小放入離心管中，加入組織量2倍的0.2%IV型膠原酶，37℃消化。向離心管中加入2ml PBS，吹打組織塊，過200目篩網，制備單細胞懸液，細胞懸液離心后棄上清，加入4ml含雙抗的10%胎牛血清重懸細胞。細胞計數并以2×106/ml細胞量接種于培養瓶中，置于恒溫細胞培養箱中25min，PBS反復沖洗2次，盡量去除未貼壁細胞，以純化細胞。更換含雙抗的10%胎牛血清4ml，置于恒溫細胞培養箱中培養，次日換液，以后每2～3d換液一次。

2.2 MTT法繪制細胞生長曲線：收集第4代成纖維細胞，分為實驗組和空白對照組。實驗組加入含A型肉毒毒素5U/0.1ml（臨床常規濃度范圍）的1%胎牛血清DMEM，空白對照組培養液中不加A型肉毒毒素。以1×104/孔的濃度接種細胞于96孔板，96孔板每一行設5個復孔，同時設空白組1孔（僅加入培養基）以作為細胞孔的調零對照。每天在相同的時間點取孔板的一行進行檢測，連續8d。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制出兩組細胞的生長曲線。

2.3 觀察肉毒毒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響：收集第4代成纖維細胞，分成6組，實驗組和空白對照組各3組。實驗組加入含A型肉毒毒素5U/0.1ml的1%胎牛血清DMEM，空白對照組培養液中不加A型肉毒毒素。72h后流式細胞儀檢測，觀察細胞凋亡情況：六孔板中的細胞用PBS洗滌一次，加入1ml 0.25%胰酶消化細胞，待細胞變圓且有部分細胞懸浮時加入PBS終止消化。用移液槍輕輕吹打細胞，使細胞懸浮。收集于流式管中，離心、棄上清。加入3ml 4℃預冷的PBS完全重懸細胞，1 500r/min離心5min，棄上清，沉淀用300μl的Binding Buffer重懸。加入5μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5μl Propidium Iodide混勻。室溫下避光反應5min。于1h內進行流式細胞儀檢測。

2.4 統計學分析：采用SPSS13.0軟件進行統計分析，兩組間的細胞光密度值比較采用兩樣本t檢驗，兩組間細胞凋亡率比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 A型肉毒毒素對成纖維細胞增殖能力的影響：成纖維細胞的生長曲線均呈上升“S”形，有明顯的潛伏期、指數增殖期和平臺期，符合細胞生物學的生長規律。空白對照組第3天開始進入對數增長期，實驗組第5天開始進入對數增長期（圖1）。從指數增殖期開始，相同時間點測得兩組細胞的光密度值（OD值），差異均具有統計學意義（P<0.05）。

3.2 A型肉毒毒素對成纖維細胞凋亡的影響：從流式散點圖可知，加入A型肉毒毒素作用于成纖維細胞后，實驗組出現早期凋亡和晚期凋亡的細胞較空白對照組均明顯增多（圖2）。通過χ2檢驗發現，實驗組與空白對照組樣本比較，成纖維細胞凋亡率差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

4 討論

瘢痕疙瘩是良性皮膚纖維組織的增生性病變，其中成纖維細胞的過度增殖是瘢痕疙瘩的主要病理組織學特征之一[9]。成纖維細胞凋亡在創傷后組織修復過程中具有重要影響，細胞凋亡與瘢痕疙瘩的形成也有密切關系[10-11]。A型肉毒毒素作為有效預防和治療瘢痕疙瘩的可能方法，其對瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞的增殖和凋亡的影響還有待于深入研究，這有助于進一步闡明肉毒毒素治療瘢痕疙瘩的作用機制。

為了觀察A型肉毒毒素對成纖維細胞的影響，筆者通過獲取人瘢痕疙瘩組織標本，在體外培養瘢痕疙瘩成纖維細胞，然后加入A型肉毒毒素作用于成纖維細胞。應用MTT法繪制成纖維細胞的生長曲線可以發現，實驗組細胞指數增殖期延遲，而且進入平臺期細胞的OD值顯著低于空白對照組的細胞OD值，差異具有顯著統計學意義，這說明A型肉毒毒素對成纖維細胞的增殖有一定的抑制作用，這可能是肉毒毒素對瘢痕疙瘩發揮治療作用的原因之一。進一步運用流式細胞學技術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，A型肉毒毒素作用后，成纖維細胞的早期和晚期凋亡率較空白對照組明顯增加，差異具有統計學意義，這表明A型肉毒毒素可以一定程度地誘導成纖維細胞的凋亡，也提示其對瘢痕疙瘩的治療作用可能是通過促使成纖維細胞凋亡，減少膠原分泌來實現的。

本研究表明，A型肉毒毒素既可以抑制成纖維細胞的增殖，又能促進其凋亡，進而達到治療瘢痕疙瘩的目的。但是在臨床治療中，有關A型肉毒毒素使用的濃度和劑量，沒有統一的標準[12-13]。本研究中參考國內臨床使用A型肉毒毒素常用的劑量方案[14-15]，按照50U/1ml的濃度來配置，經體外實驗研究得出了上述結論。為了達到更優化的治療效果，還需要在臨床工作中探索出比較合理的A型肉毒毒素藥物配置的濃度和注射劑量。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-07-21

編輯/張惠娟