血液感染革蘭陰性菌臨床分布及耐藥性分析

黃春艷 查干

血液感染革蘭陰性菌臨床分布及耐藥性分析

黃春艷1查干2

目的研究血培養中常見的革蘭陰性細菌分布及耐藥性，為革蘭陰性菌感染的臨床用藥提供依據。方法2012年10月至2015年9月臨床送檢血液標本分離出革蘭陰性菌958株，均采用 BACTEC-FX BD 全自動血培養儀進行血培養，陽性標本BD全自動微生物鑒定/藥敏儀Phoenix-100進行鑒定，應用WHONET5.5 軟件檢測抗生素耐藥性。結果血培養分離出革蘭陰性菌958株,占前5位分別是大腸埃希菌(ECO)(23.6%)、肺炎克雷伯菌(KPN)(19.21%)、銅綠假單胞菌(PAE)(7.30%)、陰溝腸桿菌(ECL)(5.11%)、鮑曼不動桿菌(ABA)(5.00%)，PAE對阿米卡星及四環素的耐藥率低于2%，ABA對粘菌素的耐藥率最低，敏感率為100%，ECL對亞胺培南和美羅培南的耐藥率最低，為2%。產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌檢出率分別為64.5%和32.6%， 產ESBLs菌株的耐藥率(亞胺培南、美洛培南除外)明顯高于非產ESBLs菌株，差異有統計學意義(P<0.05)。結論深入了解細菌耐藥特點，定期對耐藥性數據進行分析， 有助于了解細菌耐藥性變遷，為合理使用抗菌藥物提供依據。

血培養；革蘭陰性菌；耐藥率

資料與方法

一、菌株來源

收集我院2012年10月-2015年9月住院患者血液標本中分離到的革蘭陰性菌，重復菌株只計1株。

二、質控菌株

質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和銅綠假單胞菌ATCC27853(衛生部臨床檢驗中心提供)

三、標本的采集與培養

收集武漢大學人民醫院血培養標本，根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)制定的微生物臨床檢驗標準及操作規程采集靜脈血，標本接種于 BD 公司生產的血培養瓶，藥敏試驗采用K-B紙片瓊脂擴散法測定，采用微量稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC值)采用AST-GNl3卡檢測大腸埃希酰胺酶(ESBLs)菌株藥敏結果判斷標準為CLSI2013[2]。

四、統計分析

應用WHONET5.5 軟件對耐藥性進行統計分析。計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、革蘭陰性桿菌分布情況

醫院近3年內送檢的血液標本共分離出958株革蘭陰性菌， 其中位居前5位分別是大腸埃希菌、 肺炎克雷伯菌、 銅綠假單胞菌、 陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌，構成比為50.84%,19.21%,7.30%,5.11%,5%。(見表1)。

表1 革蘭陰性菌在血流感染中分布與構成比

二、主要腸桿菌科對20種抗菌藥耐藥率(R)、敏感率(S)和最小抑菌濃度(MIC90和MIC50)。

產ESBLs的KPN與ECO構成比為32.6%和64.5%，ESBLs-KPN發生率雖明顯低于ESBLs-KPN,并且產ESBLs菌株耐藥率明顯高于非產ESBLs菌株。產ESBLs-ECO對氨芐西林及其它頭孢類耐藥率達93.94以上%，對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林鈉他唑巴坦較敏感，耐藥率均小于12.00%。產ESBLs-KPN對常用抗菌藥物耐藥率均偏高，對阿米卡星、哌拉西林鈉他唑巴坦的耐藥率分別為21.67%，33.3%，對亞胺培南、美羅培南較敏感，耐藥率均小于3.5%。同樣，ECL對第2，3代頭孢菌素以及氨曲南耐藥率多在40%-60%； 對阿米卡星、美羅培南、亞胺培南、環丙沙星、頭孢唑啉的耐藥率均小于6%外，哌拉西林鈉他唑巴坦為16.7%，復方新諾明為22.4%及對其他抗菌藥物均有不同程度的耐藥； 酶抑制劑的加入，復合制劑可較單藥MIC值降低(表2-4)。

三、非發酵菌株PAE和ABA的耐藥率(R)，敏感度(S)及最小抑菌濃度(MIC50和MIC90)

PAE對臨床常用抗菌藥物均有不同程度的耐藥，其中PAE菌株對氨曲南、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢比肟、頭孢唑琳耐藥率均為100%，復方新諾明的耐藥率為75%。 PAE對多數抗菌藥物的總體耐藥率較低，均小于20%，其中對阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、氯霉素、哌拉西林/他唑巴坦、四環素、頭孢噻肟等耐藥率均小于10%。ABA僅對粘菌素敏感，敏感率為100%；而對其他抗菌藥物的耐藥率偏高，均大于70%，對亞胺培南的耐藥率高達80%，(見表5)。

討 論

本研究對所有收集的目標菌株全部測定最小抑菌濃度(MIC50和MIC90)并通過WHONET5.5 軟件對20種常用抗生素進行耐藥率統計(見表2、3、4、5)。目前革蘭陰性菌已經成為醫院臨床標本中分離率最高的病原體，其耐藥率日趨嚴重，并呈現多重耐藥趨勢。2012年10月-2015年9月各臨床科室送檢的血液標本中共檢出958株革蘭陰性菌，其中前5位分別是大腸埃希菌(ECO)(23.6%)、肺炎克雷伯菌(KPN)(19.21%)、銅綠假單胞菌(PAE)(7.30%)、陰溝腸桿菌(ECL)(5.11%)、鮑曼不動桿菌(ABA)(5.00%)與相關文獻報道相同[3]。本研究表明臨床經驗性治療革蘭陰性菌感染時可優先選擇針對這幾種菌群的抗菌藥物。 本研究表明產ESBLs-KPN(32.6%)構成比明顯低于產ESBLs-ECO(64.5%)，但其對于含酶抑制劑的復方制劑、頭霉素類、碳青霉烯類及β-內酰胺類藥物的耐藥率均高于ECO這與李耘[4]等報道相一致,提示可能與其產酶系統更為復雜相關。

表2 大腸埃希菌的耐藥率(R)、敏感率(S)和最小抑菌濃度(MIC90和MIC50)

表3 肺炎克雷伯菌的耐藥率(R)、敏感率(S)和最小抑菌濃度(MIC90和MIC50)

腸桿菌科細菌對頭孢菌數類表現出高耐藥性，(見表2、3)顯示非產ESBLs的ECO與KPN對頭孢菌素類(頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟)的耐藥率分別為0-1.2%，0-18.2%，對產ESBLs的ECO與KPN的耐藥率為100%，81.8-100%，說明非產ESBLs的ECO與KPN對頭孢菌素類耐藥情況良好，相反，產ESBLs的ECO及KPN對頭孢菌素類有很強的耐藥性，這與Denis等[5]結果相符，因此在進行抗革蘭陰性感染治療時，需要做β-內酰胺酶測定實驗，來評判是否運用頭孢菌素類等抗菌藥物。

表4 陰溝腸桿菌的耐藥率(R)、敏感率(S)和最小抑菌濃度(MIC90和MIC50)

本研究表明復方制劑對大腸埃菌和肺炎克雷伯菌的MIC50和MIC90比單用β內酰胺類抗菌藥物降低， 尤其對產ESBLs-ECO和ESBLs-KPN的差異更為明顯，其中以哌拉西林/他唑巴坦的作用最強，這與 Anuradha等[6]研究一致。同時研究表明復方制劑對非產ESBLs-ECO和ESBLs-KPN的敏感率與單用β內酰胺類無差別，但對產ESBLs細菌而言，β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑復合物的抗菌活性明顯優于其中的單藥阿莫西林、哌拉西林和氨芐西林，其中哌拉西林/他唑巴坦效果最明顯。這與李耘[7]、歐尾株[8]等報道脲基青霉素和頭孢菌素抗菌作用優于廣譜青霉素，克拉維酸和他唑巴坦抑酶作用優于舒巴坦,單藥與酶抑制劑復方制劑抗菌活性明顯優于單藥制劑等結果一致。本研究結果顯示，產與非產ESBLs的ECO、KPN對美羅培南、亞胺培南的耐藥率均很低，為0-3%，其它種類的抗菌藥物對產ESBLs的ECO和KPN的耐藥率明顯高于非產ESBLs的ECO和KPN，產ESBLs的ECO及KPN對哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為33.3%、54.5%、90.9%，明顯高于非產ESBLs的ECO和KPN,這與[9]賈悅等報道一致。 因此,臨床上常使用碳青霉烯類和含有β內酰胺酶抑制劑的抗菌藥物對產ESBLs菌株引起的感染性疾病進行治療。從表中可以看出，血培養中ESBLs+菌株對各種抗菌藥(除美羅培南與亞胺培南)的耐藥率顯著高于ESBLs-菌株，差異有統計學意義(P<0.05),(見表2，3)。

表5 銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的耐藥率(R)、敏感率(S)和最小抑菌濃度(MIC90和MIC50)

ECL屬于腸桿菌屬，為條件致病菌，該菌對β-內酰胺類抗菌藥物如阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、哌拉西林耐藥率高，其分別為93.9%、85.7%和44.9%，而復方制劑的耐藥率相對較好，如氨芐西林/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為59.2%和16.7%；產生這種差異可能原因為ECL介導AmpC酶的基因低表達，并且具有很高的自發突變性,從而導致耐藥菌株的產生。ECL對氨基糖苷類藥物阿米卡星及碳青霉烯類亞胺培南耐藥率最低，分別為4.1%和6.2%；雖然碳青霉烯類亞胺培南等抗菌藥物仍然保持其較高的抗菌活性，但耐碳青霉烯類耐藥菌株呈增長趨勢報道也不斷增多，這可能與KPC、VIM和IMP等碳青霉烯酶的產生及Acrab-Tolc外排泵系統密切相關[10]。因此，合理運用抗菌藥物防止耐藥菌株的產生仍迫在眉睫。

非發酵革蘭陰性桿菌包括PAE和ABA，是院內感染常見病原菌，其感染一般較為嚴重，尤其在長期臥床、基礎疾病多、免疫抑制劑治療者的中多見，且伴有多重耐藥情況，給治療帶來困難。一般而言，多重耐藥的PAE和ABA感染常選用碳青霉烯類抗生素，包括亞胺培南和美羅培南，這與國外文獻報道相同[11]。但近年來，非發酵革蘭陰性菌多重耐藥及耐藥率不斷上升的特點已經引起全球的廣泛關注。

PAE廣泛存在于正常人皮膚、腸道、呼吸道及周圍環境中，對多種抗菌藥物耐藥，是目前院內感染的主要病原菌。PAE對大多數抗菌藥物均有不同程度地耐藥，包括氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢吡肟及頭孢唑啉的耐藥率為100%，復方新諾明耐藥率為75%。本院臨床分離出的PAE對亞胺培南的耐藥率為16.2%，而阿米卡星耐藥率最低，對頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、四環素 、阿莫西林/克拉維酸耐藥率為0-10.3%，耐藥情況良好，提示頭孢噻肟、頭孢他啶等仍是臨床經驗治療的首選。我院PAE對亞胺培南耐藥情況比國外嚴重[12]，為16.2%,而對慶大霉素的耐藥情況相對低一些為12.1%，這種耐藥情況的不同可能與大劑量使用同種抗菌藥物的習慣所致。

ABA作為院內感染重要病原體，耐藥形勢依舊非常嚴峻，院內該菌的克隆傳播是造成醫院感染流行的重要原因[13]。2011年衛生部全國細菌耐藥監測網( Mohnarin) 監測結果表明ABA僅次于PAE，占據臨床非發酵革蘭陰性菌感染的第二位( 占35.1%)[14]。我院醫院獲得性ABA對大多數抗菌藥物，如β-內酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類有很強的耐藥性，為70%以上，其中亞胺培南的耐藥率80%，顯示高于美國和歐洲一些地區[15]。ABA對粘菌素耐藥率最低，敏感率為100%，提示臨床上ABA的感染應謹慎選擇抗菌藥物，慎用碳青霉烯類。

綜上所述，革蘭陰性細菌耐藥性日趨嚴重，臨床必須加強對常見革蘭陰性菌耐藥率的動態性監測， 及時采集標本行微生物學鑒定及藥物敏感試驗， 并根據試驗結果選擇抗菌藥物，以實施個體化給藥方案， 降低細菌耐藥率和減緩多重耐藥菌的產生。

[1] Xiao YH,Giske CG,Wei ZQ,et al.Epidemiology and characteristics of antimicrobial resistance in China[J].Drug Resist Updat,2011,14(4-5):236-250.

[2] CLSI C.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twenty-second informational supplement[S] CLSI document M100-S23.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2013:70-86.

[3] Lu GJ.Drug resistance of 344 strains of pathogens isolated from blood culture specimens[J].Chin J Nosocomiol,2013,23(6):1439-1441.

[4] 呂媛,李耘,薛峰,等.衛生部全國細菌耐藥監測網(Mohnarin)2011-2012年度血流感染細菌耐藥監測報告[J].中國臨床藥理學雜志,2014,30(3):278-288.

[5] Denis B,Lafaurie M,Donay JL,et al.Prevalence, risk factors, and impact on clinical outcome of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli, bacteraemia: a five-year study[J].Int J Infect Dis,2015,39:1-6.

[6] Anuradha K,Sailaja VV,Umabala P,et al.Sensitivity pattern of gram negative bacilli to three beta-lactam/beta-lactamase inhibitor combinations using the automated API system[J].Indian J Med Microbiol,2007,25(3):203-208.

[7] 李耘,呂媛,薛峰,等.我國2009至2010年MOHNARIN項目臨床分離常見病原菌的耐藥監測[J].中華檢驗醫學雜志,2012,35(1):67-87.

[8] 歐尾妹,呂媛,李耘,等.β內酰胺類/β內酰胺酶抑制劑的體外抗菌活性研究[J].中國臨床藥理學雜志,2015,31(11):916-920.

[9] 賈悅,陳彥芬,郭衛力.2010年臨床常見病原菌分布及耐藥性

分析[J].中華醫院感染學雜志,2012,22(17):3871-3873.

[10] Pérez A,Poza M,Fernández A,et al.Involvement of the AcrAB-TolC Efflux Pump in the Resistance, Fitness, and Virulence of Enterobacter cloacae[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(4):2084-2090.

[11] Fera MT,Zummo S,DE Sarro A.In vitro activity studies of doripenem and two other carbapenems tested against Pseudomonas aeruginosa and other non-fermentative bacilli[J].J Chemother,2011,23(6):335-340.

[12] Memish ZA,Shibl AM,Kambal AM,et al.Antimicrobial resistance among non-fermenting Gram-negative bacteria in Saudi Arabia[J].J Antimicrob Chemother,2012,67(7):1701-1705.

[13] 呂美艷,周翠,徐琦煜,等.161株鮑曼不動桿菌OXA-23基因組介導的耐藥性和同源性分析[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(2):412-415.

[14] 李耘,呂媛,鄭波.衛生部全國細菌耐藥監測網2011年度非發酵革蘭陰性桿菌耐藥監測[J].中國臨床藥理學雜志,2012,28(12):883-887.

[15] Al Johani SM,Akhter J,Balkhy H,et al.Prevalence of antimicrobial resistance among gram-negative isolates in an adult intensive care unit at a tertiary care center in Saudi Arabia[J].Ann Saudi Med,2010,30(5):364-369.

DrugresistanceandclinicaldistributionofGram-negativebacteriastrainsfromculturingbloodsamples

HUANGChun-yan,ZHAGan

ZhongshanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China

ObjectiveTo provide the evidence for treatment of Gram-negative bacteria strains infection by investigating its distribution and drug resistance from culturing blood samples.Methods958 strains of Gram-negative bacteria isolated from October 2012 to September 2015 all used BACTEC-FX BD automatic blood culture system for culturing blood samples. The pathogens identification and resistance test were carried out by automatic microorganism identification instrument (Phoenix-100 BD), and their drug resistance was analyzed by WHONET 5.5 software.Results958 strains of gram negative bacteria were detected in blood culture of hospital, and the top 5 were Escherichia coli (ECO) (23.6%), Klebsiella pneumoniae (KPN) (19.21%), Pseudomonas aeruginosa (PAE) (7.30%), Enterobacter cloacae (ECL) (5.11%), and Acinetobacter Baumanni (ABA) (5%). The resistance rate of PAE to Amikacin and tetracycline was less than 2%. The resistance rate of ABA to colistin was the lowest and the sensitivity rate was 100%. The resistance rate of ECL to imipenem and meropenem were the lowest, about 2%. The detection rate of extended spectrum beta lactamases (ESBLs) in ECO and KPN were 64.5% and 32.6%, respectively. The drug resistance rate of ESBLs in ECO and KPN strains of various antimicrobials (with the exception of Imipenem and meropenem) in blood culture was higher than that non-producing ESBLs, and then the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionIt would be helpful for the change of bacterial resistance and the rational use of antibiotics to understand the characteristics of bacterial resistance deeply and to analyze the data of drug resistance periodically.

blood culture; Gram-negative bacteria; drug resistance rate

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.007

湖北省計劃生育委員會項目資助 (編號sj-201209)

1. 430060 湖北 武漢, 湖北省第三人民醫院呼吸內科 2. 430060 湖北 武漢，武漢大學人民醫院呼吸內科

近年院內感染的革蘭陰性桿菌不斷增多，已遠遠超過了引起院內感染革蘭陽性球菌的數量，成為院內感染的主要條件致病菌，是導致感染性休克的主要病因，而革蘭陰性耐藥菌株感染是患者住院時間長，病死率增高，醫療費用增加的主要原因。2010年前，我國一半以上革蘭陰性菌對臨床重要的抗菌藥物呈現不同程度耐藥現象，產ESBLs的ECO與KPN及耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)等耐藥菌株呈現不斷增長趨勢[1]。 因此，加強對醫院革蘭陰性菌的分布構成比和耐藥率監測，對臨床經驗性應用抗菌藥物具有重要的指導意義，且對降低革蘭陰性菌的耐藥率和多重耐藥菌的產生具有重要的臨床意義。本研究對2012年10月至2015年9月武漢大學人民醫院常見革蘭陰性菌的構成比和耐藥性進行回顧性統計分析。

2017-02-22]