三種方法檢測結核分枝桿菌復合群的比較分析

葉偉南 莫榮新 李少芳

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三種方法檢測結核分枝桿菌復合群的比較分析

葉偉南1莫榮新2李少芳3

目的初步研究恒溫擴增法(Isothermal amplification) 、環介導恒溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、改良羅氏培養基培養法在診斷結核分枝桿菌(Mtuberculosis，Mtb)復合群的臨床驗證和應用，評估這三種方法檢測Mtb復合群的效能。方法選取肇慶市8縣區的結核病防治機構2015年1月-2016年8月1496份痰標本，取587例痰培養陽性的培養物，同時進行恒溫擴增法、LAMP、改良羅氏培養法檢測Mtb復合群。結果羅氏培養法Mtb復合群陽性587例，陽性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%)，以此作金標準。恒溫擴增法檢測Mtb復合群陽性570例，陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%)，其靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%)，陽性預期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%)，陰性預期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)；LAMP檢測Mtb復合群陽性578例，陽性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%)，靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%)，陽性預期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%)，陰性預期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。結論改良羅氏培養基培養法診斷Mtb復合群具有高度的準確度和特異性，恒溫擴增法和LAMP具有等同效能，而LAMP實操比更優，更適合基層結核病實驗室應用。

資料與方法

一、資料

1 液體培養菌株：收集2015年1月-2016年8月在結核病防治機構就診的肺結核或疑似肺結核患者1496份痰標本， 取BBL MGIT 960培養陽性的587例菌株，其中肇慶市結核病防治所237例、各縣區慢病站：高新區4例、高要105例、四會41例、廣寧117例、懷集46例、德慶25例、封開12例。

2 儀器與試劑：羅氏培養基(培養和鑒定管)廣東省結核病防治研究所提供，BBL MGIT 7mL Tubes由美國Becton Dickinson and Company提供，Mtb復合群核酸檢測試劑盒(恒溫擴增法)，PCR熒光檢測儀由廣州迪澳生物科技有限公司提供。Mtb復合群核酸檢測試劑盒(LAMP)，由廣州華鋒生物科技有限公司提供。

二、方法

1 羅氏培養法：在磨菌瓶加入 1-2 滴10% 吐溫 -80 ，無菌吸管尖端刮取新鮮菌落置于瓶中。旋緊瓶蓋振蕩器混旋 0.5-1分鐘。加入少許滅菌的PBS。將懸濁液轉移至比濁管中，加PBS 使其濁度與標準麥氏比濁管( MacFarland No.1 )一致。無菌操作逐步稀釋至10-2mg/mL。22 SWG 標準接種環分別沾1環菌液，均勻接種至接種到硝基苯甲酸 ( PNB )及噻吩-2-羧酸肼( TCH )鑒定培養基，于36 ±1℃培養至四周觀察記錄結果，將TCH培養基上生長判定是NTM；PNB培養基上不生長判定是Mtb復合群。

2 恒溫擴增法：Mtb核酸檢測 (恒溫擴增法)按照試劑盒說明書操作，將培養陽性的培養物1mL加入100μ離心去上清液，加1mL 生理鹽水離心去上清液，加100μDNA提取液，100℃下加熱10min，離心后提取2μL上清液到PCR管中混勻擴增，PCR熒光檢測儀擴增檢測。利用擴增曲線來判斷結果，呈S型為陽性(含結核分枝桿菌)，無S型則為陰性。每輪設陰陽性對照管。

3 LAMP：Mtb復合群核酸檢測 (環介導恒溫擴增法)按照試劑盒說明書操作，將培養陽性的培養物1mL離心去上清液，加入100μDNA裂解液，100℃下裂解10min，離心后提取2.5μL到HF反應管中，65℃反應60min，顛倒混勻數次后肉眼觀察顏色變化判斷結果，陽性綠色，陰性橙色。每輪設陰陽性對照管。

三、統計學方法

采用Microsoft Excel2007軟件統計，SPSS 19.0統計學軟件，三種方法比較采用四格表卡方檢驗，計數資料采用百分率及其95%CI表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、羅氏培養法與恒溫擴增法對比

羅氏培養法Mtb復合群陽性587例，陽性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%)，以羅氏培養法作為金標準，恒溫擴增法陽性570例，陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%)，靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%)，陽性預期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%)，陰性預期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。兩種方法結果比較，Kappa=0.91高于0.8，代表檢測效果完全一致，(見表1)。

表1 羅氏培養法與恒溫擴增法的一致性對比

注： Kappa=0.91 ，P=0.011 ，Z=35.26

二、羅氏培養法與LAMP對比

以羅氏培養法作為金標準，LAMP法陽性578例，陽性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%)，靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%)，特異度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%)，陽性預期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%)，陰性預期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)，兩種方法結果比較， Kappa=0.90 高于0.8，說明兩種方法具有同等效能，(見表2) 。

表2 羅氏培養法與LAMP的一致性對比

注： Kappa=0.90，P=0.012 ，Z=34.82

三、恒溫擴增法與LAMP

兩種方法一致性比較， Kappa=0.97 高于0.8，代表兩種方法檢測結果完全一致，(見表3 ) 。

表3 恒溫擴增法與LAMP的一致性對比

注： Kappa=0.97 ，P=0.006，Z=37.69

討 論

羅氏培養法，是鑒定Mtb復合群的傳統方法，也是金標準，因其操作簡單，經濟，推廣易，已在臨床廣泛應用[2-3]。原理是PNB在一定的濃度下(500μg)選擇性抑制Mtb復合群生長，而不抑制NTM生長，達到Mtb復合群確認。該方法特異性和靈敏度較高，但檢測期長(4周)，不利于結核病早診療的原則。

目前國內外已應用PCR技術檢測Mtb復合群[4-5]，LAMP 法是日本學者 Notomi 在 PCR 技術的基礎上創建的一種新的基因檢測手段。恒溫擴增法和LAMP的檢測原理基本相同，引物均采用基因IS6110作為Mtb復合群檢測靶標序列。Bst聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對Mtb DNA片段進行特異性擴增，測定其生成的產物來判斷結果。新興LAMP近年已在結核病防治方面得到廣泛應用和研究[6-7]。

恒溫擴增法和LAMP，在Mtb復合群診斷時，均具有靈敏度高，假陰性低，避免非特異性或污染造成的假陽性，(見表1、表2)。二種方法能顯著縮短診斷時間，3小時可得結果，操作上均需加溫、離心、擴增幾個步驟。由表1和表2得出，兩種方法在特異度、靈敏度以及診斷效能都具有完全一致性。本研究顯示，恒溫擴增法檢測Mtb復合群的陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%)，與陳濤等[8]結果基本一致， 但需在開放性的PCR管中加樣混勻，易產生氣溶膠造成二次污染，還需配備專業的PCR熒光檢測儀檢測擴增曲線；而LAMP陽性率為38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%)，與沈會平的結果基本相同[9]，其操作時加樣到密封的HF反應管內擴增，過程完全在封閉的PCR管中進行，并與核酸染料SybrGreenⅠ結合，生成有色反應物，肉眼即可判斷結果，且無需三個變控溫度擴增，儀器的需求。因此， LAMP與另二種方法相比，操作快速、方便、簡單、安全、經濟有效，并可現場測定確認。進一步分析綜合陽性率為38.7%(95%CI: 37.2%-40.1%)，說明本地區感染Mtb復合群較為嚴重，待加強結核病診治水平，建議各基層防治機構(慢性病防治站) 盡快提升實驗室水平，及早應用快速、有效的LAMP分子生物學檢測方法，為臨床治療提供有力依據。由于多種原因，筆者沒有對耐多藥的Mtb復合群專項研究，有待今后工作中完善。

上述三種方法在診斷Mtb復合群均具有高度的準確度和特異性，具有同等效能，而LAMP實操比更優，更適合于條件落后的基層結核病實驗室推廣應用。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.047

肇慶市科技創新計劃項目(No 00189901150419047)

1. 526020 廣東 肇慶，肇慶市結核病防治所檢驗科 2. 520061 廣東 肇慶，肇慶學院醫院檢驗科 3. 526070 廣東 肇慶，肇慶市鼎湖區人民醫院二門診部

WHO 2015年制定戰略的目標，是在2015-2035年將結核病死亡率降低95%，將新發病例減少90%。而我國是全球22個高負擔國家之一，僅次于印度，位居世界第二[1]， 近年仍有近50萬人感染耐多藥Mtb。目前結核病防治診斷主要依賴臨床表現，影象學和實驗室的診斷，而Mtb復合群確診以羅氏培養基培養法為主要的可靠手段。但Mtb生長緩慢的特性(6-8周)，限制了檢出率，隨著實驗室技術不斷發展，出現了熒光定量PCR方法，恒溫擴增法，LAMP等分子生物學檢測方法診斷Mtb復合群。本研究通過對肇慶市結核病防治所2015年1月-2016年8月587份BBL MGIT 960培養陽性的培養物，用三種方法進行Mtb復合群檢測，對結果進行比較分析和驗證，進一步對分子生物學診斷Mtb復合群進行比較分析。

2017-02-04]