細菌革蘭雙重16S rRNA基因熒光定量PCR快速診斷婦產科菌血癥

任明保 ，李 揚 ，趙金輝 ，劉 晶 ，王建華

（1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院 產一科，北京 100026；2.北京婦產醫院 檢驗科，北京 100026；3.首都兒科研究所 分子研究室，北京 100020）

細菌革蘭雙重16S rRNA基因熒光定量PCR快速診斷婦產科菌血癥

任明保1，李 揚1，趙金輝2，劉 晶2，王建華3

（1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院 產一科，北京 100026；2.北京婦產醫院 檢驗科，北京 100026；3.首都兒科研究所 分子研究室，北京 100020）

目的：用已知細菌革蘭陰性、陽性菌雙重16S rRNA基因熒光定量PCR方法（q-PCR）應用于婦產科患者菌血癥的診斷，探討該方法檢測婦產專科患者菌血癥的臨床應用價值。方法：2013年1月～2014年12月對100例疑為全身感染處于菌血癥狀態的住院分娩孕產婦進行常規血液培養，同時用細菌革蘭陰性、陽性菌雙重16S rRNA基因q-PCR方法檢測，分析2種方法診斷菌血癥的陽性率、敏感性和特異性。結果：通過q-PCR方法檢測菌血癥陽性率44%，血液培養陽性率16%，兩者差異有統計學意義（P＜0.01）；菌血癥臨床診斷陽性率為37%，與q-PCR法陽性率存在顯著性差異（P＜0.01）。以血液培養陽性和（或）臨床診斷菌血癥的標準作為對照，q-PCR方法診斷敏感性為89.2%，特異性82.5%。結論：細菌革蘭陰性、陽性菌雙重16S rRNA基因q-PCR方法檢測婦產科菌血癥的陽性率高于血液培養，可快速為孕產婦患者感染提供早期、敏感的病原學診斷依據。

孕產婦；菌血癥；熒光定量聚合酶鏈反應

感染是婦產科患者圍手術和圍分娩期常見的并發癥，病原菌侵入血液通過血行播散到體內各部位可造成菌血癥，全身表現有發熱、寒戰、乏力等，局部表現有傷口紅腫、滲液、化膿等，如不及時治療可能會危及生命。因此，臨床上要求早期快速準確診斷菌血癥。常規血培養法是診斷菌血癥的金標準，但存在耗時長、診斷慢、花費高、陽性率低、因一次采血量較大患者依從性差、培養結果受主觀因素及抗菌藥物影響等缺點。隨著分子生物學技術的發展，細菌的16S rRNA作為微生物分類依據已得到廣泛認同。因此，我們采用已建立的細菌革蘭陰性、陽性菌雙重16S rRNA基因q-PCR方法，對100例住院分娩疑似感染處于菌血癥狀態的患者進行檢測，旨在探索婦產科菌血癥的早期診斷方法和治療依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取北京婦產醫院2013年1月～2014年12月100例疑似感染處于菌血癥狀態的患者，參照最新菌血癥診斷指南，分為血液培養陽性的確診血液感染和臨床診斷血液感染，臨床診斷血液感染依據2001年國家衛生部 《醫院感染診斷標準》中血液感染標準：體溫＞38℃或低體溫＜36℃，伴有寒戰，并合并下列情況之一：有入侵門戶或遷徙病灶；有全身中毒癥狀而無明顯感染灶；有皮疹或出血點、肝脾腫大、血液中性粒細胞增多伴核左移，且無其他原因可解釋；收縮壓＜90mmHg或收縮壓下降＞40mmHg。對照組選擇40例同期住院的非感染性疾病患者。

1.2 試劑與儀器

血液培養檢測采用美國BD公司9240全自動血液培養儀。細菌革蘭陰性、陽性菌雙重16S rRNA基因q-PCR方法檢測采用ABI 7300熒光定量PCR分析儀，PCR引物和探針依據細菌16S rRNA基因保守區域，均由浙江大學醫學院兒童醫院中心實驗室合成。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922及金黃色葡萄球菌ATCC 25923，均購于衛生部臨床檢驗中心。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

無菌條件下，取待檢血液標本50μl，加到1.5ml離心管中； 加 50μl DNA 提取液（10mmol/L羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽pH7.6，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基硫酸鈉）振蕩充分混勻，37℃搖床搖勻30min后置100℃干浴10min，12000rpm離心5min，保留上清備用。

1.3.2 引物與探針

選擇細菌16S rRNA基因高保守的區域設計引物，在該引物的片段范圍內，通過MegAlign分析軟件分別設計針對所有細菌共有的通用探針，對革蘭陽性菌特異的革蘭陽性探針，對革蘭陰性菌特異的革蘭陰性探針。引物序列：上游引物（P967F），CAACGCGAAGAACCTTACC （967-985bp）； 下游引物 （P1194R）， ACGTCATCCCCACCTTCC（1194-1177bp）；革蘭氏陽性菌探針，FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA；革蘭氏陰性菌探針，HEX-ACGACAGCCATGCAGCACCT-TAMRA。

1.3.3 q-PCR方法

圖1 陽性質控品及陰性對照增長曲線圖

抽取上清液2μl作為模板，在ABI 7300檢測儀按下列程序進行PCR反應：94℃ 預變性2min后，94℃ 15s、60℃ 60s為一個循環，共循環40次。每次PCR循環均設陽性、陰性對照。陽性對照為大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923；陰性對照為注射用水，不加DNA模板。

1.3.4 結果報告

將Baseline曲線初始值設置為7～18，熒光值設置為 4000，使 Correlation 數值介于-1.0～-0.97，FAM通道為革蘭陽性菌，HEX通道為革蘭陰性菌。 PCR完畢計算循環閾值（cycle threshold，Ct）。如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值≥35的標本，為陰性。若樣本的Ct值＜35，則根據不同的革蘭陰、陽性不同探針通道判定結果，其中FAM通道為革蘭陽性菌，HEX通道為革蘭陰性菌。本檢測方法的靈敏度和線性范圍，根據臨床考核結果，靈敏度為 1.0×103copies/ml， 線性范圍為 1.0×103～1.0×109copies/ml。

1.3.5 血液培養

血液培養方法參照臨床常規血液培養方法。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計數資料比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 質量控制

陰性對照：增長曲線不呈S型曲線或Ct值≥35；陽性質控品：增長曲線呈S型，且陽性質控品定量參考 Ct值＜35（圖 1）。

2.2 血標本2種檢測方法的結果比較

100份標本中基于16S rRNA基因q-PCR方法的檢測陽性患者44例，陽性率為44%；血培養陽性16例，陽性率為16%。兩者差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 q-PCR方法與臨床診斷指標的結果比較

100例病例中，基于臨床診斷指標的陽性患者37例，陽性率為37%，顯著低于q-PCR的檢測陽性率 44%（P＜0.01）。 以血液培養陽性和（或）以臨床診斷菌血癥作為對照，PCR的診斷敏感性為89.2%（33/37），診斷特異性為 82.5%（52/63）。

3 討論

婦產科菌血癥的感染診斷臨床上缺乏特異性的指征，血液培養雖是菌血癥診斷的金標準，但其陽性率不高，所需時間長，患者的依從性相對較差。因此，不能達到早期診斷的目的。目前臨床診斷菌血癥多依靠患者的臨床表現和其他指標如體溫、血像、CRP、PCT等，但是這些感染指標均存在特異性不足的問題。

隨著分子生物學技術的發展，細菌的16S rRNA作為微生物分類依據已得到廣泛認同。16S rDNA基因是細菌染色體上編碼16S rRNA對應的DNA序列，集保守性和變異性于一身[1，2]，存在于所有細菌的染色體基因組中，在病毒、真菌等非原核生物體內并不存在，其編碼基因長度約為1500bp，既能反映不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術得到其序列，目前幾乎所有病原菌的16S rRNA基因測序均已完成，因此，常被選為細菌PCR擴增的目標序列。近年來，國內外開始研究細菌16S rRNA熒光定量PCR方法檢測菌血癥中的病原菌。浙江大學吳亦棟等的研究 “細菌革蘭雙檢實時熒光定量PCR檢測試劑盒”獲得專利 （專利號200720192588）。該方法以細菌16SrRNA基因為靶序列，設計通用引物及革蘭陰、陽性雙特異TaqMan探針，建立了細菌16Sr-RNA基因革蘭雙檢實時熒光定量PCR反應體系。此方法能檢測出所有細菌，并能區分革蘭氏陽性和陰性菌[3]；而且由于反應在封閉系統，除了具有快速（3h出結果）、敏感性高、特異性高、成本低、采血量少外，還可避免污染。吳亦棟等[3]用該技術對512例新生兒敗血癥進行了檢測，并與血培養方法進行對比。結果發現，細菌檢出陽性率，熒光定量PCR方法顯著高于血培養方法 （P＜0.01），熒光定量PCR方法陽性率為44%。這種檢測方法在婦產科菌血癥檢測方面的研究還鮮見報道。本研究在前期研究基礎上，通過引入革蘭陰、陽性雙特異TaqMan探針對婦產科疑為菌血癥及具有高危因素或臨床癥狀的患者進行實時熒光PCR定量檢測細菌16SrDNA序列，同時與血培養儀連續監測法比較，對熒光定量PCR法的敏感性和特異性進行研究，旨在探索婦產專科患者菌血癥病原菌的快速、準確的檢測方法[4，5]。

相關報道顯示，應用熒光定量PCR檢測16S rRNA基因對早期菌血癥或疑似血源性感染的患者，可提供快速準確的治療依據[6，7]。本研究結果發現，若以血液培養陽性和（或）以臨床診斷血液感染作為對照，q-PCR方法的診斷敏感性為89.2%，診斷特異性為82.5%，說明基于16S rRNA基因的q-PCR方法是一種有很大潛力和價值的診斷方法。同時，通過分別合成革蘭陽性探針和革蘭陰性探針，可以進一步判斷血液感染的病原菌為革蘭陽性球菌或革蘭陰性桿菌，為臨床醫師有針對性的選擇抗菌藥物抗感染治療提供幫助。此外，該方法檢測快速，從采集標本到PCR擴增只需4～6h即可完成，而通常血液培養至少需要3～5d，顯著提高了工作效率。

本試驗的數據顯示，q-PCR方法的陽性率為44%，遠高于血液培養的陽性率16%，亦高于臨床診斷指標37%，說明q-PCR方法能夠發現其他方法無法查到的細菌感染。100例患者中，16例為血液培養陽性確診的菌血癥，37例臨床診斷的菌血癥，共計診斷菌血癥為37例。其中q-PCR方法檢測陽性33例，11例檢測假陽性的原因在于臨床診斷指標特異性較低，此外，在q-PCR方法操作過程中也有發生污染的可能。分析q-PCR方法檢測與常規血液感染診斷不符合的原因，可能由于q-PCR體系中血紅蛋白等抑制物存在較多或抽提過程中細菌DNA的丟失而導致q-PCR方法假陰性[8，9]，以及存在某些特殊培養條件的細菌如L型細菌等或某些無法培養的細菌[10]。由于本試驗只涉及細菌引起的血液感染，對真菌、病毒、支原體屬、衣原體屬等其他病原體引起的血液感染尚不能提供診斷幫助。

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Rapid diagnosis of bacterimia in gynecological and obstetric patients with FQ-PCR as coding 16S rRNA gene

REN Ming-bao，LI Yang，ZHAO Jin-hui，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Aug，31（4）：218-221

Objective：To develope a fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR）method based on 16S rRNA genes for the diagnosis of infections in gynecological and obstetric patient in order to improve the efficiency and accuracy of bacterial detection.Methods：One hundred patients suspected with bacterimia were cultured and bacterial 16S rRNA gene were detected synchronously by extraction of DNA，primer and probe design，PCR amplification and fluorescent quantitative detection of amplified products.The positive rate，sensitivity and specificity of these two methods were compared.Results：The positive rate was 44% by FQ-PCR，which was significantly higher than 16%by blood culture （P＜0.01）.Taking the criteria of positive blood culture and/or clinical diagnosis of bacterimia as control，the sensitivity was 89.2%and the specificity was 82.5%for FQ-PCR.Conclusion：The positive rate of FQ-PCR was significantly higher than that of blood culture and could be an early and sensitive method for pathogenic diagnosis of bacterimia in gynecological and obstetric patients.

pregnant woman；bacterimia；fluorescence quantitative polymerase chain reaction

R714

A

1001-0025（2017）04-0218-04

doi∶10.3969/j.issn.1001-0025.2017.04.005

Authors addressDepartment of Obstetric，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China

任明保（1970-），男，副主任醫師，醫學博士。

2016-12-15

2017-03-02