3種方法治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘大鼠對腸道菌群的影響

付 雯，劉興隆，張瓏瓊，高永翔

(成都中醫藥大學 610075)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.007

3種方法治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘大鼠對腸道菌群的影響

付 雯，劉興隆，張瓏瓊，高永翔△

(成都中醫藥大學 610075)

目的根據“肺與大腸相表里”的理論，為肺腸合治法治療腸道菌群失調并過敏性哮喘提供理論依據。方法實驗共分了空白組、模型組、陽性組和3種中藥復方的給藥組；采用頭孢哌酮加白色念珠菌灌胃SD大鼠的方式復制腸道菌群失調，并在此基礎上運用卵清清蛋白注射致敏與霧化誘發哮喘，霧化同時分別給予加味升降散、桂枝加厚樸杏子湯和增液承氣湯藥液從肺腸合治、治肺和治腸進行治療；采用Buxco全身體積描記系統分析呼吸功能，通過16SrDNA分析腸道菌群的變化。結果根據OTU值分析各組腸道菌群物種組成發現，各組對乳酸桿菌的恢復接近空白組且優于陽性組，3個治療組均可促進變形菌門和擬桿菌門菌群的恢復，但肺腸合治效果最佳，通過Alpha 多樣性分析發現腸道微生物菌群多樣性從高到低分別是治腸組、治肺組、肺腸合治組、模型組；呼吸頻率和氣道高反應性模型組為260.56(1.28)，治療后肺腸合治組、治肺組和治腸組分別為141.79(0.93)、137.25(1.30)和203.16(0.84)，各治療組大鼠呼吸頻率均低于模型組，而氣道高反應性只有肺腸合治組和治腸組低于模型組且差異有統計學意義(P<0.05)。結論肺腸合治法治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘大鼠在肺功能和腸道菌群恢復上優于單純治腸或治肺法。

哮喘；腸道菌群；中醫治療學

過敏性哮喘(allergic asthma)是由多種細胞特別是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞參與的慢性氣道炎癥[1]。大量研究表明哮喘患者的腸道菌群多樣性均發生變化，提示過敏性哮喘與腸道菌群的多樣性關系密切[2-3]；臨床研究也發現，在利用常規手段治療過敏性哮喘患者同時調節患者的腸道菌群，恢復腸道微生態，可提高過敏性哮喘的治療效果，而且復發率更低[4]。中醫認為：“肺與大腸相表里，肺病及腸，腸病亦可及肺”[5]。現代醫學研究也表明肺與腸關系密切，并且二者均參與了公共黏膜免疫系統的構成。因此，本研究基于“肺與大腸相表里”的理論，筆者提出在治法上分別從肺腸合治、治肺、治腸治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘大鼠，研究3種治法對模型大鼠腸道菌群和呼吸功能的影響，為中醫治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雄性，體質量(200±20)g，購于簡陽達碩動物科技有限公司，許可證號：SCXK(M)2008-15(川)。SD大鼠飼養于標準大鼠塑料籠中，動物自由進食及飲用生活飲用水。動物房溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，空氣流通。

1.2儀器與試劑 頭孢哌酮(華北制藥河北華民藥業有限責任公司，批號PC5130301)；枯草芽孢桿菌二聯活菌(后簡稱媽咪愛，北京韓美藥品有限公司，批號20131250)；氨茶堿(西南藥業股份有限公司，批號20140302)；QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qtagen，批號145050844)；白色念珠菌(廣東環凱微生物科技有限公司，批號A0081B)；ELISA Kit for sIgA(上海一研生物科技有限公司，批號LOT201411)。

1.3各組處理方案及模型構建方法

1.3.1空白組 適應性喂養結束后，以無菌水代替生活飲用水，生理鹽水代替卵清清蛋白(OVA)進行灌胃、注射致敏和霧化吸入。

1.3.2模型組 適應性喂養結束后，給予SD大鼠0.5 g/L的頭孢哌酮水溶液，自由飲用，連續處理5 d。第6天將生活飲用水換成無菌水，同時單次灌胃109cfu/mL的白色念珠菌50 μL，使其定植腸道，以進一步加重腸道菌群失調。將配制好的OVA凝膠致敏劑，分別于第0天和第7天于大鼠雙側胸部和腹股溝共4點皮下注射各0.15 mL，同時腹腔注射0.40 mL，共1.00 mL。第14天開始將大鼠置于10 cm×10 cm×20 cm有機玻璃盒內，超聲霧化吸入1% OVA以誘發哮喘，每天1次，每次30 min，連續7 d。

1.3.3陽性組 造模后從激發當天開始以媽咪愛+氨茶堿灌胃，連續7 d。

1.3.4給藥組 造模后，從激發當天開始3種方藥根據成人每日中藥的服用量，依據《藥理實驗方法學》人和鼠之間體積比換算系數進行換算，以換算后的劑量灌胃大鼠，連續7 d。各組藥物具體灌胃方案見表1(人體質量按60 kg計算)。

表1 各組處理方案

1.4藥物制備及給藥方法

1.4.1桂枝加厚樸杏子湯 治腸組采用桂枝加厚樸杏子湯，桂枝9 g，炙厚樸6 g，杏仁6 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗3枚。

1.4.2增液承氣湯 治肺組采用增液承氣湯，玄參30 g，麥冬(連心)24 g，細生地24 g，大黃9 g，芒硝4.5 g。

1.4.3加味升降散 肺腸合治組采用加味升降散，炒僵蠶10 g，蟬衣6 g，姜黃10 g，酒大黃10 g，炙麻黃6 g，苦杏仁10 g，黃芩10 g，厚樸10 g。以上藥物均購于成都市北京同仁堂藥房，經成都中醫藥大學藥學院李敏教授鑒定為正品，熬制成每1 mL藥液含生藥1 g的濃縮液，高溫滅菌后冷藏備用。

1.5大鼠腸道16SrDNA的檢測 根據實驗分組，每組均取6只動物，根據QIAamp DNA Stool Handbook操作說明提取糞便DNA，每個樣本DNA各取20 μL混合均勻。將提取的基因組DNA 送深圳華大基因科技服務有限公司，分析3個樣本的腸道菌群的物種基因組成。

1.6大鼠呼吸功能測定 利用Buxco動物肺功能分析系統進行測定。

1.7肺組織標本的病理切片分析 處死大鼠，迅速沿正中線打開胸腔，取下右肺下葉，固定好肺組織并用石蠟進行包埋。最后進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色處理。

1.8支氣管肺泡灌洗液(BALF)、腸黏膜sIgA的檢測 提取BALF和腸黏膜黏液，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測sIgA水平。

2 結 果

2.1大鼠呼吸功能測定 模型組大鼠的呼吸頻率顯著高于空白組和陽性組(P<0.01)；但對于氣道高反應性指標而言，3組差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 大鼠呼吸頻率和氣道高反應性比較

*：P<0.05，**：P<0.01，與空白組比較；▲▲：P<0.01，與陽性組比較

2.2BALF細胞的EOS計數 模型組BALF中的嗜酸性粒細胞(3.36±0.43)顯著高于空白組(1.66±0.33)和陽性組(1.0±0)，差異有統計學意義(P<0.01),見表3。

A：空白組；B：模型組；C：陽性組；編號1代表放大倍數100倍，編號2代表放大倍數400倍

圖1肺組織HE染色觀察

2.3肺組織HE染色觀察 空白組大鼠(圖1A)的肺組織未見明顯炎性細胞；模型組(圖1B)肺組織中可見明顯的炎性細胞浸潤，同時氣管壁增厚伴氣管管腔縮小。陽性組大鼠的肺組織(圖1C)炎性細胞明顯少于模型組，但比空白組仍有較多炎性細胞，氣管管壁增厚的狀態有所緩解。

2.4BALF和腸黏膜的sIgA水平 模型組BALF中的sIgA水平顯著低于空白組(P<0.05)；同時腸黏膜中sIgA的水平模型組顯著低于空白組、陽性組(P<0.01、P<0.05)，見表3。

表3 BALF和腸黏膜中sIgA的水平(n=8)

*：P<0.05，**：P<0.01，與空白組比較，▲：P<0.05，與陽性組比較

2.5大鼠腸道16SrDNA的分析

2.5.1OTU及其豐度分析 各處理組內的物種豐度可通過OTU初步反映。模型組腸道菌群的物種豐度分別比治腸組和治肺組低10.82%和13.6%，但高于肺腸合治組。

2.5.2物種及其豐度分析 將不同樣品的物種根據OTU值，按照門、綱、目、科、屬進行分類，并跟數據庫的數據進行比對，做出各樣品物種profiling的柱狀圖。模型組的腸道乳酸桿菌比治腸組、治肺組和肺腸合治組分別低86.88%、77.2%和74.69%，而且3個治療組跟陽性組相比，分別高了82.7%、82.6%和80.72%；模型組的變形菌門數量比治腸組、治肺組和肺腸合治組分別低13.4%、29.69%和80.4%，見圖2。

圖2 各處理組在各分類等級上的物種profiling柱狀圖

2.5.3樣品復雜度分析 (1)單個樣品復雜性分析：模型組物種多樣性最低，各治療組的物種多樣性從高到低分別是治腸組、治肺組、肺腸合治組，見表4。(2)不同樣品物種組成聚類分析：在物種組成相似性上，肺腸合治組、治肺組和模型組最接近，陽性組和治腸組則跟模型組距離稍遠，空白組距離其他5組均較遠。

2.6大鼠呼吸功能測定 呼吸頻率空白組為(119.07±19.41)次，模型組(260.56±36.94)次，陽性組(153.05±14.65)次，肺腸合治組(141.79±28.88)次，治肺組(137.25±26.37)次，治腸組(203.16±17.52)次。各治療組大鼠呼吸頻率均顯著低于模型組(P<0.01)，而且治肺組與肺腸合治組跟空白組的差異無統計學意義(P>0.05)。氣道高反應性空白組0.95±0.21，模型組1.28±0.09，陽性組1.07±0.11，肺腸合治組0.93±0.12，治肺組1.3±0.44，治腸組0.84±0.16，肺腸合治組和治腸組均低于模型組且差異有統計學意義(P<0.05)，其他各組差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 樣品Alpha多樣性統計結果

observed species、chao、ace指數：反映樣品中群落的豐富度； shannon、simpson指數：反映群落的多樣性

3 討 論

本實驗分別從肺腸合治、治肺和治腸三個角度利用加味升降散、桂枝加厚樸杏子湯、增液承氣湯治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘大鼠。選方依據：桂枝加厚樸杏子湯首載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第18條“喘家作，桂枝湯，加厚樸、杏子佳”與第43條“太陽病，下之，微喘者，表未解故也，桂枝加厚樸杏子湯主之。”此方是中醫“傷寒論”中治療哮喘病癥的經典方之一，同時已有許多研究表明此方可以治療哮喘。廖偉平[6]利用加減該方的方法治療變異型哮喘患者35例，試驗結果表明治療組顯效率88.6%，對照組(常規西藥)顯效率53.3%；而1年后復發率治療組為14.3%，對照組為40.0%，可見該方治療效果顯著優于對照組，因此作為從肺治療的方藥；《溫病條辨·中焦篇》第17條指出：“陽明溫病，下之不通，其證有五……津液不足，無水舟停者，間服增液，再不下者，增液承氣湯主之。”增液承氣湯具有滋陰增液，泄熱痛便的功效。肖陽娥等[7]利用該方治療40例慢性呼吸衰竭患者發現，中醫治療組有效率達到82.5%，而對照組僅56.6%，差異有統計學意義(P<0.05)。王愛華[8]利用該方治療喘證患者，發現患者服用10劑后即康復。根據“肺與大腸相表里”理論，增液承氣湯可以承氣清熱、增液益津，從而達到化痰降氣平喘的功效，因此作為從腸治肺的方藥；升降散源于明代醫家張鶴騰編著的《傷暑全書》，后得清代醫家楊粟山發揮載于《傷寒瘟疫條辨》[9]。該方以僵蠶為君，蟬蛻為臣，姜黃為佐，大黃為使，米酒為引，蜂蜜為導。魯恒心[10]研究發現利用升降散加減治療咳嗽變異型哮喘38例，有效率高達92.11%；靳文學等[11]利用加味升降散治療過敏性哮喘豚鼠，結果表明加味升降散可下調哮喘豚鼠肺內sIgA的高免疫狀態。筆者在主方基礎上，加了炙麻黃、苦杏仁、黃芩和厚樸。麻黃和杏仁加強了該方的升降作用；黃芩清肺解毒，泄肺之郁熱；厚樸下氣平喘，通暢腑氣，作為肺腸合治的方藥。

本實驗結果顯示，所有治療組腸道菌群中正常菌群的數量均有不同程度的提高，有害菌群數量降低，但是對于腸道微生物菌群多樣性的恢復，治腸組優于其他兩組。但肺腸合治組對變形菌門和擬桿菌門的恢復效果最佳，說明肺腸合治法對于腸道優勢菌種的恢復比單純治腸法更有優勢。升降散的應用目前國內主要集中在呼吸道疾病或外感發熱等疾病上[12-13]。本實驗發現該方對腸道菌群的恢復具有療效，還可應用于腸道疾病的治療。

對于改善過敏性哮喘的典型癥狀呼吸頻率和氣道高反應性而言，3組均能有效地降低呼吸頻率，但只有肺腸合治組對氣道高反應性也有比較好的改善作用，說明肺腸合治法在對過敏性哮喘呼吸功能的恢復上優于單純治肺法和單純治腸法。這與國內其他學者利用肺腸合治法治療過敏性哮喘的實驗結果一致[14]。

綜上所述，肺腸合治的治療方法對于治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘大鼠在肺功能和腸道菌群恢復上都具有明顯的優勢和療效，可作為治療該病的首選治療方案，為中醫治療腸道菌群失調合并過敏性哮喘提供了實驗依據。治腸方在腸道菌群多樣性的恢復上具有明顯優勢，而且治肺組對腸道致病菌梭狀芽孢桿菌的抑制作用最優，因此可通過重新配伍的方法找到一個更優的肺腸合治方。

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Influenceofthreedifferenttherapeuticmethodsonintestinalfloraintreatingratintestinaldysbacteriosiscomplicatingallergicasthma*

FuWen,LiuXinlong,ZhangLongqiong,GaoYongxiang△

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China)

ObjectiveTo provide a theoretical basis for the pulmonary enteric therapy in treating intestinal dysbacteriosis complicating allergic asthma according to the traditional theory of "Lung and Large intestine are interiorly-exteriorly".MethodsThe experiment included the blank group,model group,positive control group and three kinds of traditional Chinese medicine compound administration group;the intestinal dysbacteriosis in SD rats was duplicated by adopting cefoperazone and candida albicans gavage.On this basis ovalbumin injection sensitization and nebulization were applied to induce asthma.Meanwhile Jia-Wei-Sheng-Jiang Powder(SJS),Guizhi-Jia-Houpu-Xingzi Decoction(GHX) and Zeng-Ye-Cheng-Qi Decoction(ZYCQ) were orally administered for treatment of lung-intestine combine therapy,lung therapy and intestine therapy.The respiratory function was analyzed by using the Buxco whole body plethysmography.The variety of intestinal flora were analyzed by using 16SrDNA.ResultsAnalyzing the specieces composition of intestinal flora in each group by the OUT value found that the recovery of Lactobacillus in each group was close to that in the blank group and better than that in the positive group,meanwhile,3 treatment groups all could promote the recovery of Proteobacteria and bacteroidetes,but the lung-intestine combine therapy had optimal effect,the Alpha diversity analysis found that the intestinal microflora diversities from high to low were in turn the intestinal therapy group,lung therapy group,lung-intestine combined therapy group and model group;the respiratory frequency and airway hyperreactivity in the model group was 260.56(1.28),which in the lung-intestine combined therapy group,lung therapy and intestine therapy after treatment were 141.79(0.93),137.25(1.30)and 203.16(0.84)respectively, the rat respiratory frequency in each treatment group was lower than that in the model group,while the airway hyperreactivity only in the lung-intestine combined therapy group and intestinal therapy group was lower than that in the model group,moreover showing statistical significance.ConclusionThe lung-intestine combine therapy method for treating rat intestinal dysbacteriosis complicating allergic asthma is superior to simple lung therapy method or intestine therapy method.

asthma;intestinal microflora;therapeutics

R256.12

A

1671-8348(2017)25-3477-03

2016-12-22

2017-07-10)

國家自然科學基金資助項目(81303085)；成都中醫藥大學科技發展基金資助項目(ZRYY1620)。

付雯(1983-)，博士，講師，主要從事中西醫結合基礎研究。

△通信作者，E-mail:406084191@qq.com。