清氣化痰湯對哮喘小鼠肺部炎癥的影響

陳 竹，彭 玉，龐 平，楊見輝，羅貞清

(貴陽中醫學院第二臨床醫學院兒科，貴陽 550001)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.006

清氣化痰湯對哮喘小鼠肺部炎癥的影響

陳 竹，彭 玉，龐 平，楊見輝，羅貞清

(貴陽中醫學院第二臨床醫學院兒科，貴陽 550001)

目的觀察清氣化痰湯對哮喘小鼠氣道炎癥和肺組織炎性反應的干預作用。方法將45只BALB/c小鼠分為正常對照組(CON組)、哮喘模型組(MOD組)、地塞米松組(TRE組)、清氣化痰湯組(X1組)、清氣化痰湯聯合地塞米松組(X2組)。通過卵清清蛋白和氫氧化鋁凝膠進行致敏和霧化建立哮喘小鼠模型。取支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞計數、嗜酸性粒細胞計數及觀察肺組織病理變化。結果與CON組比較，MOD組BALF 細胞計數和嗜酸性粒細胞計數明顯增多，TRE組、X1組、X2組BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數均明顯減少，TRE組和X2組治療后第15天與第5天比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；各治療組均能減輕小鼠肺組織病理炎性浸潤，減少肺大泡產生、氣道上皮增厚，X2組炎癥損傷輕。結論清氣化痰湯能減輕氣道炎癥，改善模型小鼠的肺組織炎性反應。

哮喘；炎癥;清氣化痰湯

哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，其以氣道炎、氣道高反應性、氣道重塑為特征[1]。哮喘是一個全球性的疾病，其發病率呈逐年增高的趨勢[2]。兒童是哮喘的高發人群，我國第3次全國兒科哮喘流行病學調查結果顯示，全國0～14歲兒童哮喘患病率為0.42%～5.73%，平均為3.02%，較10年前增加了53.3%[3]。很多研究證實哮喘的發生及嚴重程度與嗜酸性粒細胞性氣道炎癥有關[4]。清氣化痰湯是全國名老中醫黃建業教授治療哮喘痰熱壅肺的經驗方，臨床療效確切。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察清氣化痰湯對哮喘模型小鼠肺部炎癥和肺組織病理炎性損傷的影響，探討其對哮喘的防治作用，為臨床推廣名老中醫經驗方及進一步研究其作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，SPF級[合格證號SYXK(黔)2012-001]，購自貴州省實驗動物工程中心。

1.2儀器與試劑 2%氫氧化鋁凝膠購自Invivo Gen公司；卵清清蛋白(OVA)購自Sigma公司；注射用地塞米松磷酸鈉購自馬鞍山豐原制藥有限公司，每支5 mg(批號150512-1)。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Masson 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3藥物 清氣化痰湯由膽南星、全瓜蔞、法夏、浙貝、枳殼、陳皮、茯苓、杏仁等10味中藥組成。

1.4方法

1.4.1造模方法 第1、8、15天腹腔注射OVA及氫氧化鋁凝膠混合液0.2 mL(內含OVA 60 μg及2.25 mg氫氧化鋁凝膠)致敏；第21天開始用5% OVA溶液8 mL行超聲霧化，每次30 min，連續霧化5 d進行激發，建立動物模型。CON組用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化。每天觀察小鼠一般情況，并稱取各組小鼠的體質量。

1.4.2分組及給藥 將45只小鼠采用隨機數字表法分為5組，每組9只：(1)正常對照組(CON組)，用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化，不給藥；(2)哮喘模型組(MOD組)，按1.4.1方法進行致敏和激發，不給藥；(3)地塞米松組(TRE組)，按1.4.1方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)；(4)清氣化痰湯組(X1組)，按1.4.1方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min灌胃給予中藥0.3 mL；(5)清氣化痰湯聯合地塞米松組(X2組)，按1.4.1方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min灌胃給予中藥0.3 mL，腹腔注射地塞米松(0.25 mg/kg)，每天1次，連續15 d。1 mL藥液相當于 5.4 g生藥。

1.4.3BALF細胞計數 于治療后第5、15天每組各處死小鼠3只，同時從氣管注射無菌生理鹽水0.5 mL入肺，抽吸3次后將抽出液體即支氣管肺泡灌洗液(BALF)凍存于-20 ℃；取150 μL BALF細胞懸液與細胞計數液按1∶1稀釋混勻，顯微鏡下計數細胞總數，余下BALF 4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取沉淀物涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察，每個標本計數200個細胞，共觀察10個視野計數。

1.4.4肺組織病理觀察 處死小鼠后，取右肺置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，每張切片隨機選取左、右、上、中、下5個視野，觀察各組小鼠肺組織病理變化。

2 結 果

2.1小鼠一般情況及體質量觀察 (1)在致敏階段，各組小鼠一般情況均較好，無明顯差別；開始激發后，MOD、TRE、X1組和X2組小鼠均出現煩躁、精神萎靡、進食減少等變化，各組間無明顯差異。(2)MOD組小鼠體質量較CON組下降，其他治療組小鼠體質量介于二者之間(圖1)。

圖1 各組小鼠體質量變化

2.2各組小鼠BALF 細胞計數和嗜酸性粒細胞計數 與CON組比較，MOD組BALF 細胞計數和嗜酸性粒細胞計數明顯增多(P<0.05)；TRE組治療后第5天與第15天BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數無明顯差異(P>0.05)；X1組在治療15 d后BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數較治療第5天時明顯減少，其治療效果有明顯差異(P<0.05)；X2組治療后第5天與第15天BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數比較也有明顯差異(P<0.05)；3個治療組中X2組治療5 d與15 d后BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數下降最為顯著(表1)。

表1 BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數

#：P<0.01，與CON組比較；*：P<0.05,**：P<0.01，與MOD組比較

A：CON組;B：MOD組;C：TRE組;D：X1組;E：X2組

圖2治療5 d后各實驗組肺組織病理變化(HE×200)

A：CON組;B：MOD組;C：TRE組;D：X1組;E：X2組

圖3治療15 d后各實驗組肺組織病理變化(HE×200)

2.3肺組織病理觀察 (1)治療5 d后肺組織病理觀察：CON組小鼠肺組織結構正常，肺泡、小血管、支氣管等結構完整，氣管壁和肺泡周圍無炎癥細胞浸潤；MOD組肺組織中肺大泡形成，肺充血，肺泡內出現泡沫樣滲出物，間質水腫，可見淋巴細胞、單核細胞浸潤，肺組織中氣道上皮增厚，管腔狹窄，肺間質出現淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤；TRE和X1組肺泡間質炎癥較重，肺泡間隔增寬，可見淋巴細胞、單核細胞浸潤，肺泡內可見炎性滲出物；X2組小鼠肺部炎癥減輕，肺泡結構完整，肺間質可見少量淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤(圖2)。(2)治療15 d后肺組織病理觀察：CON組小鼠肺組織結構正常，肺泡、小血管、支氣管等結構完整，氣管壁和肺泡周圍無炎性浸潤；MOD組小鼠肺組織炎癥減輕，部分可見肺充血，肺泡內出現泡沫樣滲出物，間質水腫，可見淋巴細胞、單核細胞浸潤，肺組織中氣道上皮增厚，管腔狹窄，肺間質出現淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤；TRE和X1組肺泡間質仍有炎癥，肺泡間隔增寬，可見淋巴細胞、單核細胞浸潤，肺泡內可見炎性滲出物；X2組小鼠肺部炎癥進一步減輕，肺泡結構完整，肺間質可見少量淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤(圖3)。

3 討 論

祖國醫學中雖沒有支氣管哮喘的病名，但在《素問·逆調論》、《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣篇》已經有類似哮喘的記載，《諸病源侯論·咳嗽病諸侯》就提出“呷嗽者，猶是咳嗽也，其胸膈痰飲多者，嗽則氣動于痰，上搏咽喉之間，痰氣相擊，隨嗽動息，呀呷有聲，謂之呷嗽”，所描述癥狀與支氣管哮喘相符。兒童哮喘的發病率高與兒童的生理病理密切相關。小兒肺臟嬌嫩，脾常不足，腎常虛。人體水液的正常代謝為肺脾腎三臟所司，若三臟功能失調，則致水液代謝失常，痰濁內生。如因外邪犯肺或感觸異物、吸入異氣，肺治節無權，水津失于輸布，凝液為痰；兒童脾常不足，脾虛不能為胃行其津液，運化失司，濕聚為痰，上貯于肺；腎氣虛衰，不能蒸化水液，也能使水濕上泛為痰。臨床不論何種證型均表現為咳嗽氣喘，喉間痰鳴。中醫認為痰易生并伏儲于氣道是哮喘發作的病理基礎，痰易生難消成為治療哮喘的一個難點。結合現代醫學對哮喘病因病理機制的認識，推測哮喘“痰飲伏肺”的中醫病理特征與現代醫學哮喘氣道炎癥、氣道重塑存在必然的聯系[5]。

清氣化痰湯是本院國家級名老中醫黃建業教授治療痰熱咳喘的經驗方，由膽南星、全瓜蔞、法夏、浙貝、枳殼、陳皮、茯苓、杏仁等10味中藥組成。膽南星、全瓜蔞共為君藥，可疏泄實痰實火之壅閉，寬胸散結，達到清化肺內痰熱，理氣止咳目的。法夏為辛溫之品，與苦寒之黃芩、浙貝相配共為臣藥，一化痰散結，一清熱降火，既相輔、相制又相成；佐以杏仁降利肺氣以宣上，枳殼、陳皮理氣化痰以寬胸；茯苓健脾滲濕以杜生痰之源；焦楂消積以助脾運。全方具有清熱化痰、止咳平喘的作用。

本研究采用藥物激發制造小鼠哮喘模型，在進行激發后除CON組小鼠外，其余各組小鼠均出現煩躁、精神萎靡、進食減少、體質量下降等變化，尤其是MOD組小鼠體質量持續下降明顯。提示哮喘作為一個慢性氣道炎癥，可對患者的精神及體格生長造成影響，這對處于生長發育時期的兒童危害更大。大量研究表明，炎癥在哮喘的發病中發揮著至關重要的作用，肺組織的嗜酸性粒細胞能夠介導氣道高反應性、氣道重塑等病理改變[6-8]。本研究發現TRE組在治療后5 d BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數較X1組低，但組內比較，治療5 d與15 d后BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數無明顯差異，說明激素治療在疾病早期可較快抑制炎性反應，但隨著治療時間的延長其治療效果并未明顯增強。X1組在治療5 d后雖然BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數都較TRE組高，但在治療15 d后其治療效果有明顯差異，上述數值均隨著藥物持續給予逐漸下降，接近激素治療效果，說明清氣化痰湯在抑制炎癥介質釋放方面雖然起效慢，但隨著治療時間的延長治療效果逐漸增強。X2組在治療5 d與15 d BALF細胞計數和嗜酸性粒細胞計數均低于TRE、X1組，且組內比較有明顯差異，提示清氣化痰湯與激素在減少炎癥介質釋放、控制炎性反應方面有協同治療作用。

氣道的炎癥和氣道功能受損，二者存在密切聯系，支氣管氣道的炎癥主要表現在嗜酸細胞的增多及浸潤，而支氣管氣道功能受損主要表現為上皮結構和功能改變[9]。本研究建立的哮喘模型均出現了氣道炎癥和功能的受損。有研究指出氣道結構和功能的改變是支氣管哮喘病理改變的核心環節，氣道上皮可以促使Th2細胞因子表達增加[10]，這些細胞因子對成熟嗜酸細胞具有趨化和激活作用，直接參與了哮喘的發病和氣道炎癥的形成[11-12]。本研究發現X1組的病理改變輕，無肺大泡、氣道上皮未增厚，說明清氣化痰湯的治療作用不僅是抑制嗜酸細胞等炎癥介質的釋放還在維護氣道上皮的完整性、調節免疫方面有積極作用。X2組小鼠肺組織病理示炎癥較X1、TRE組輕，肺泡結構完整，肺間質僅見少量淋巴細胞和嗜酸細胞浸潤。說明清氣化痰湯在減輕小鼠肺組織炎癥浸潤方面療效與激素相似，并且在與激素聯合使用時能明顯修復肺組織的病理損傷。

通過研究證實，清氣化痰湯治療哮喘、減輕咳喘痰鳴癥狀的作用機制是抑制炎癥介質的釋放，減少肺組織中炎性滲出，減輕肺組織損傷。但清氣化痰湯與激素聯合使用能更好地保護肺組織的機制，需要進一步實驗研究。

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EffectofQingqihuatanDecoctiononpulmonaryinflammationinasthmaticmouse*

ChenZhu，PengYu，PangPing，YangJianhui，LuoZhengqing

(DepartmentofPediatrics,SecondClinicalMedicalCollege,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550001，China)

ObjectiveTo observe the interventional effect of Qingqihuatan Decoction on airway inflammation and inflammatory reaction of lung tissue in asthmatic mouse.MethodsForty-five BALB/c mice were randomly divided into the normal control group(CON),asthmatic model group(MOD),dexamethasone group(TRE),Qingqihuatan Decoction group(X1) and Qingqihuatan Decoction combined dexamethasone group(X2).The asthmatic mouse model was established by the sensitization and inhalation of OVA and aluminium hydroxide gel.The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was performed the cell counts and eosinophil counts,and the pathological changes of lung tissue were observed.ResultsCompared with CON group,BALF cell count and eosinophil count in the model group were increased obviously,which in the treatment group were significantly decreased.The effect of the X1 group and X2 group had statistical difference between on 5 d and 15 d.(P<0.05 orP<0.01);the treatment groups could reduce the pathogenical infiltration,lung bullae production and airway epithelial thickening of mouse lung tissue,especially the inflammation damage in X2 group was mild.ConclusionQingqihuatan Decoction can relieve the airway inflammation and improves the lung tissue inflammatory response in model mouse.

asthma;inflammation;Qingqihuatan Decoction

R272

A

1671-8348(2017)25-3473-04

2016-12-18

2017-06-06)

貴州省科學技術資金資助項目(黔科合LH字[2014]7314號)；貴州省衛生和計劃生育委員會科學技術基金資助項目(gzwjkj2014-2-124)。

陳竹(1976-)，碩士，副教授，主要從事兒童呼吸系統疾病的中西醫結合防治研究。