紅景天苷對小鼠宮頸癌移植瘤中Eag1表達的影響和意義

章麗霞，王 濤，牛彩琴

(川北醫(yī)學院，四川南充 637000)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.005

紅景天苷對小鼠宮頸癌移植瘤中Eag1表達的影響和意義

章麗霞，王 濤，牛彩琴△

(川北醫(yī)學院，四川南充 637000)

目的檢測紅景天苷對小鼠宮頸癌移植瘤中Eag1表達情況的影響及其意義。方法建立小鼠宮頸癌U14細胞皮下移植瘤模型，將40只雌性昆明小鼠分為移植瘤組、順鉑組、紅景天苷組和順鉑、紅景天苷聯(lián)合組，每天用游標卡尺測量腫塊大小，采用電子天平稱量瘤質(zhì)量并計算抑瘤率，采用免疫組織化學法證實移植瘤為未分化鱗癌，取移植瘤組的瘤旁組織為對照組。采用RT-PCR和Western blot檢測各組小鼠宮頸癌移植瘤中Eag1 mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果皮下注射宮頸癌 U14 細胞建立昆明小鼠皮下移植瘤模型成瘤率100%。順鉑組、紅景天苷組及聯(lián)合組移植瘤的體積及瘤質(zhì)量均低于移植瘤組，聯(lián)合組移植瘤的體積及瘤質(zhì)量明顯低于順鉑組和紅景天苷組(P<0.05)；移植瘤組、順鉑組、聯(lián)合組Eag1 mRNA和蛋白表達明顯高于對照組，順鉑組、紅景天苷組、聯(lián)合組Eag1 mRNA和蛋白表達均低于移植瘤組，聯(lián)合組Eag1表達水平低于順鉑組和紅景天苷組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論紅景天苷能抑制小鼠宮頸癌移植瘤的生長及Eag1表達，與順鉑聯(lián)用效果更為顯著。

宮頸腫瘤； 紅景天苷；小鼠，裸

紅景天是一種具有廣泛的藥理作用的天然中草藥植物，其主要有效成分是紅景天苷。紅景天苷對體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-435細胞[1]、肺腺癌 SPC-A-1 細胞[2]、肝癌 HepG-2 細胞[3]等有一定的抑制作用，動物實驗也證實紅景天苷具有抑制體內(nèi)移植瘤如人胃腺癌 BGC-823 荷瘤小鼠[4]和Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長、提高小鼠生存期的作用[5]。本研究采用順鉑、紅景天苷及二者聯(lián)合對小鼠宮頸癌移植瘤進行干預，觀察移植瘤的生長及Eag1的表達情況，為紅景天苷應用于臨床治療宮頸癌進行初步研究,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物采用健康6～8周齡雌性昆明小鼠40只，體質(zhì)量(27±3)g，購自川北醫(yī)學院實驗動物中心；小鼠宮頸癌U14細胞由川北醫(yī)學院影像研究所惠贈；紅景天苷購自上海源葉生物科技有限公司，純度HHPLC=98%，規(guī)格20 mg/支；順鉑注射液由云南個舊生物有限公司生產(chǎn)，批號130802；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Hyclone公司；Eag1多克隆抗體購自美國Abcam公司；即用型CK5/6鼠抗人單克隆抗體、即用型P63鼠抗人單克隆抗體、即用型非生物素免疫組織化學檢測試劑盒、枸櫞酸修復液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；β-actin(BA2305)、增強型RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、超敏ECL化學發(fā)光即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol、TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠宮頸癌移植瘤模型的建立及分組 U14細胞用含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。將對數(shù)生長期的U14細胞離心后用生理鹽水以適當比例稀釋成1×106個/mL的細胞懸液，取0.5 mL注入3只小鼠腹腔。飼養(yǎng)4～7 d可見小鼠腹部膨隆略成蛙腹狀，形成U14腹腔積液瘤小鼠。抽取乳糜色腹腔積液，稀釋細胞濃度至1×106個/mL，乙醇擦拭接種小鼠左前肢腋下靠后背部位皮膚，吸取0.2 mL細胞懸液皮下注射，3～4 d后，在注射部位可觸及米粒至綠豆大結(jié)節(jié)，蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(p63、CK5/6)證實結(jié)節(jié)為未分化鱗癌，即造模成功。接種后第7天(成瘤第4天)隨機分為4組，每組10只，順鉑組每只隔天腹腔注射3 mg/kg[9]的順鉑，連續(xù)注射7次；紅景天苷組每天腹腔注射960 mg/kg[4]的紅景天苷，連續(xù)注射12次；順鉑、紅景天苷聯(lián)合組(簡稱聯(lián)合組)給予紅景天苷960 mg/kg腹腔注射(每日1次)+ 順鉑3 mg/kg腹腔注射(隔日1次)；移植瘤組隔天腹腔注射無菌生理鹽水0.2 mL；對照組為移植瘤組腫瘤旁組織。每日同一時間觀察小鼠的體質(zhì)量、精神、活動量等情況，用游標卡尺測量移植瘤大小。

1.2.2移植瘤體積及質(zhì)量測定 造模成功的小鼠給予不同處理結(jié)束后2 d，頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤組織，用游標卡尺測量移植瘤最長徑與最短徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×最長徑×最短徑2；用電子天平稱量瘤質(zhì)量并計算抑瘤率，抑瘤率=(移植瘤組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量)/移植瘤組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.3免疫組織化學法 將移植瘤蠟塊組織3 μm連續(xù)切片4張，脫蠟水化，1張做HE染色，其余3張以3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 min×3次，0.01 mmol/L pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復抗原3 min，冷卻后PBS洗3 min×3次，滴加即用型一抗p63、CK5/6和代替一抗的PBS，4 ℃冰箱過夜。再按照即用型非生物素免疫組織化學檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4RT-PCR法 按Trizol總RNA抽提試劑盒說明提取小鼠宮頸癌移植瘤組織總RNA。紫外分光光度儀測定其濃度后，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明獲得cDNA。運用Primer 5.0軟件設計引物，Eag1及內(nèi)參照β-actin基因的引物見表1。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)(內(nèi)參照β-actin基因30個循環(huán))；72 ℃延伸10 min，以2%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR結(jié)果。用Image Lab軟件對條帶進行吸光度掃描分析,以相應目的條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值進行半定量分析。

表1 Eag1、β-actin RT-PCR引物序列

1.2.5Western blot法 取移植瘤組織及腫瘤旁組織100 mg剪碎，加入1 mL蛋白裂解液勻漿后，移至EP管置于4 ℃繼續(xù)裂解2～3 h，4 ℃ 12 000 r/m離心15 min后去上清液，提取組織總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。上清液與上樣緩沖液4∶1混合，100 ℃變性5 min，每孔上樣40 μg，8% SDS-PAGE凝膠電泳，恒壓95 V分離樣品；200 mA轉(zhuǎn)膜100 min；用5%脫脂奶粉/TBST在室溫封閉1 h；加一抗稀釋液Eag1(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)4 ℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，二抗(1∶3 000)室溫孵育2～3 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL發(fā)光。使用Image Lab軟件分析目的蛋白的灰度值，通過目的蛋白Eag1與β-actin內(nèi)參照灰度值對比，得出相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1小鼠宮頸癌移植瘤的確立 HE染色切片經(jīng)本院病理科專家閱片，結(jié)合免疫組織化學檢測p63與CK5/6均為陽性表達，證實腫塊為宮頸未分化鱗癌(圖1)。

A:移植瘤HE染色；B：宮頸癌移植瘤組織p63表達；C：宮頸癌移植瘤組織CK5/6表達

圖1宮頸癌移植瘤組織染色

2.2各干預組對小鼠宮頸癌移植瘤抑制作用 干預后，順鉑組、紅景天苷組和聯(lián)合組的腫瘤體積比移植瘤組小，以聯(lián)合組的體積最小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組小鼠宮頸癌移植瘤體積變化情況

干預結(jié)束2 d后處死小鼠，由表2可見各干預組的移植瘤瘤質(zhì)量小于移植瘤組，聯(lián)合組的小鼠移植瘤的瘤質(zhì)量最小(P<0.05)，聯(lián)合組的抑瘤率最高。

表2 各干預組移植瘤的質(zhì)量及抑瘤率

2.3各組Eag1 mRNA的表達 各組組織中的Eag1 mRNA的平均灰度值經(jīng)SNK法單因素分析，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，移植瘤組Eag1 mRNA表達高于對照組，各干預組中的Eag1 mRNA表達低于移植瘤組，聯(lián)合組中的Eag1 mRNA表達最低，見圖3A、表3。

2.4各組Eag1蛋白表達 以β-actin為內(nèi)參，由圖3B可見各組均可見Eag1特異性的蛋白條帶，各組組織中的Eag1蛋白的平均灰度值經(jīng)SNK法單因素分析，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，移植瘤組Eag1表達高于對照組，各干預組中的Eag1表達低于移植瘤組，聯(lián)合組Eag1表達最低，見圖3B、表3。

表3 各組的Eag1 mRNA 和Eag1蛋白的表達

A：mRNA表達；B：蛋白表達

圖3各組Eag1蛋白表達

3 討 論

隨著宮頸癌普查、普治項目的開展，宮頸癌的發(fā)病率和病死率持續(xù)下降，但年輕女性宮頸癌的發(fā)病率卻明顯上升。宮頸癌的主要治療方法是放化療配合手術(shù)切除，經(jīng)過手術(shù)治療或者放療后超過35%的局部晚期宮頸癌患者發(fā)展為持續(xù)性、復發(fā)、轉(zhuǎn)移性宮頸癌，鉑類為基礎的藥物作用依然是治療的金標準[6]。但由于其不良反應及毒副作用限制了臨床的藥物劑量，尋找抑制并消滅腫瘤細胞的化療輔助藥物，成為近年來治療腫瘤的新途徑。

紅景天是一種具有廣泛藥理作用的天然中草藥植物，其主要有效成分是紅景天苷。紅景天苷是紅景天屬植物的主要活性成分，具有抗癌、抗細胞凋亡、抗疲勞、抗缺氧作用及對心、腦具有保護作用[7]。紅景天苷對細胞的毒副作用是通過調(diào)節(jié)周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases 4，CDK4)-cyclin D1途徑抑制G1期，或者通過調(diào)節(jié)CDK2-cyclin B1途徑抑制G2期[8]。研究顯示，紅景天苷處理過的肝癌細胞在G0/G1期百分數(shù)明顯增加，S期和G2/M期細胞減少，表明在G0/G1期阻斷腫瘤生長。本研究建立小鼠宮頸癌U14細胞皮下移植瘤模型，通過對移植瘤組織進行HE染色和免疫組織化學檢測p63、CK5/6，證實腫塊為宮頸未分化鱗癌，實驗發(fā)現(xiàn)順鉑組、紅景天苷組和聯(lián)合組移植瘤的體積都比移植瘤組小，以聯(lián)合組的最小，證實了紅景天苷能抑制移植瘤生長，并且和順鉑聯(lián)合使用抑制腫瘤效果更好。

Eag1是鉀離子通道蛋白的成員，在RNA水平Eag1主要存在于正常腦組織中，少量表達于成肌細胞、胎盤、睪丸和腎上腺中[9-12]。Eag1通道有助于控制神經(jīng)元興奮性[13]。研究發(fā)現(xiàn)Eag1在超過75%的非中樞神經(jīng)腫瘤中大量表達，如口腔鱗癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等[14-17]。已有研究表明Eag1蛋白隨著宮頸病變的程度的加重表達逐漸增強，并與宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示Eag1的表達在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起十分重要的作用[18]。本實驗采用RT-PCR和Western bolt對移植瘤中Eag1的表達情況進行檢測顯示：宮頸癌移植瘤組織中的Eag1表達明顯高于瘤旁組織(P<0.01)。可能與Eag1通道由PRB/E2F1通路的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控促進腫瘤細胞增殖和腫瘤生長，由HPV-E7腫瘤蛋白抑制E2F1轉(zhuǎn)錄因子使Eag1表達增加有關(guān)。在癌細胞和非轉(zhuǎn)化細胞增殖過程中，E2F1轉(zhuǎn)錄因子與Eag1啟動子在(或接近)G2/M期直接結(jié)合使Eag1瞬時表達，通過磷酸化CDK1(Y15)和持續(xù)的pRb磷酸化顯示在癌細胞和非轉(zhuǎn)化細胞中缺乏Eag1可延長G2/M期，因此，Eag1表達耦合到細胞周期進展，促進正常和腫瘤細胞中的G2/M進展[19]以及與預后不良相關(guān)。Eag1的表達與腫瘤治療密切相關(guān)，有望成為腫瘤靶向治療的靶點。也有研究發(fā)現(xiàn)放療前宮頸癌中Eag1的陽性表達率高于放療后。本實驗結(jié)果顯示：順鉑組、紅景天苷組和聯(lián)合組瘤組織中Eag1表達均低于移植瘤組(P<0.05)。證實Eag1的表達與腫瘤治療密切相關(guān)。聯(lián)合組中Eag1表達均低于順鉑組和紅景天苷組，提示紅景天苷可以輔助化療宮頸癌。

綜上所述，Eag1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，是宮頸腫瘤的標志物之一，也是一個預后因子或作為各種類型癌癥治療靶點。紅景天苷可通過抑制宮頸癌中Eag1這個治療靶點的表達輔助化療，為紅景天苷的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和腫瘤的治療提供了新思路。

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EffectandsignificanceofsalidrosideonEag1expressioninmousecervicalcancerxenograft*

ZhangLixia,WangTao,NiuCaiqin△

(NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo investigate the effect and significance of salidroside on Eag1 expression in mouse cervical cancer xenograft.MethodsThe mouse subcutaneous xenograft model of cervical cancer U14 cells was established.Forty female Kunming mice were divided into 4 groups according to the random principle,the xenograft group,cisplatinum group,salidroside group and cisplatinum combined salidroside group.Then the mass size was measured by using the vemier caliper everyday.The xenograft tumor weight was measured by using the electronic scale and the tumor inhibiting rate was calculated.The immunohistochemistry method was adopted to verify that the xenograft tumor was undifferentiated squamous cell carcinoma.The tumor surrounding tissue in the xenograft group was taken as the control group.RT-PCR and Western blot were adopted to detect the expression levels of Eag1 mRNA and protein in mouse cervical cancer xenografts in each group.ResultsKunming mice renograft tumor model was established by subcutaneous injection of cervical cancer U14 cells,the tumor formation rate was 100%.The tumor volume and tumor weight in the cisplatinum group,salidroside group and combined group were lower than those in the senograft group,the xenograft tumor volume and tumor weight in the combined xenograft group were significantly lower than those in the cisplatinum group and salidroside group (P<0.05);the expressions of Eag1 mRNA and protein in the xenograft group,cisplatinum group and combined group were significantly higher than those in the control group,while which in the cisplatinum group,salidroside group and cisplatinum combined salidroside group were significantly lower than those in the xenograft group,the Eag1 expression level in the combined group was lower than that in the cisplatinum group and salidroside group,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionSalidroside can inhibit the growth of cervical cancer xenograft and Eag1 expression,and the effect in the combined use with cisplatinum is more significant.

uterine cervical neoplasms;salidroside;mice,nude

R737.33

A

1671-8348(2017)25-3470-03

2016-12-19

2017-06-07)

四川省教育廳重點項目(14ZA0182)；四川省教育廳一般項目(12ZB225)。

章麗霞(1977-)，碩士，副教授，主要從事婦科腫瘤病理和法醫(yī)病理學方面的研究。

△通信作者，E-mail:niucaiqin@126.com。