負壓創面治療術對大鼠脂肪干細胞遷移行為的影響

李曉明，劉 蘋，汪 超，楊佳佳，姚仕采，張 波△

(1．第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所，重慶 400042；2．重慶醫科大學附屬兒童醫院PICU/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.003

負壓創面治療術對大鼠脂肪干細胞遷移行為的影響

李曉明1，劉 蘋1，汪 超2，楊佳佳1，姚仕采2，張 波1△

(1．第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所，重慶 400042；2．重慶醫科大學附屬兒童醫院PICU/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014)

目的探討負壓創面治療術(NPWT)對大鼠脂肪干細胞(ADSCs)遷移行為的影響。方法8頭體質量為(20±2) kg巴馬小香豬，分別接受假手術(A組，n=16)、持續負壓吸引(B組，n=8)和間歇負壓吸引(C組，n=8)，治療72 h后觀察3個月。細胞水平觀察NPWT對ADSCs遷移行為的影響，提取大鼠ADSCs，采用8 h持續負壓吸引和間歇負壓作用于ADSCs，Transwell檢測ADSCs遷移能力，MTT檢測細胞增殖能力，Western blot法檢測缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達。結果B組和C組創面愈合效果明顯優于A組；與A組比較，B、C組ADSCs細胞遷移數量差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，而細胞增殖差異均無統計學意義(P>0.05)；HIF-1α表達與ADSCs細胞遷移結果一致。結論NPWT通過上調HIF-1α蛋白表達進而促進大鼠ADSCs遷移。

負壓創面治療術；脂肪干細胞；遷移

創面難愈是目前醫學界關注的熱點和難點，尤其是糖尿病足、壓迫性潰瘍等癥狀，嚴重影響著人們的健康。負壓創面治療術(negative-pressure wound therapy,NPWT)作為一種加快患者創面愈合的新方法，多應用于難愈性創面的治療并在臨床治療中取得了很好的療效，但其作用機制尚不明確[1-2]。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)具有多向分化潛能、取材方便、來源充足等優點，被稱為修復治療中的“種子細胞”，有研究表明，局部移植ADSCs可有效促進皮膚創面組織修復[3-5]。因此，假設NPWT可通過上調ADSCs遷移，進而促進皮膚創面組織修復，縮短創面愈合時間。本實驗主要目的在于觀察NPWT對大鼠ADSCs遷移行為的影響，進一步探討NPWT促進創面愈合的作用機制，以便更好地將NPWT應用于難愈性創面相關疾病的研究及治療。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8頭巴馬小香豬，雌雄不限，體質量(20±2)kg；10只雌性3月齡SD大鼠，體質量(200±20)g。動物由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所動物實驗中心提供，動物使用許可證號：SYXK(渝)2012-0010。

1.2儀器與試劑 儀器主要包括組織勻漿器(德國Miltenyi)，8 MV Precise醫用直線加速器(瑞典Elekta)，負壓引流儀(山東威高)，低溫離心機(美國Thermo)，電泳儀(美國Bio-Rad)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad)，核酸蛋白定量儀(美國Thermo)。試劑主要包括BSA(武漢博士德生物)，MTT(美國Hyclone)，結晶紫(成都科龍)，0.4 μm Transwell小室(美國Corning)，蛋白酶抑制劑(美國Roche)，cDNA試劑盒(大連寶生物)，缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)抗體(北京博奧森)，GAPDH抗體(北京博奧森)，辣根過氧化物酶山羊抗兔(聯科生物)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore)，增強型ECL顯色液(美國Thermo)，BCA試劑盒(碧云天)。

1.3方法

1.3.1分組及難愈性創面模型制備 小香豬在動物實驗前12 h禁食，10 mg/kg氯胺酮快速麻醉，5～10 min后肌內注射0.5 mg/kg地西泮和25 mg/kg阿托品，后續視動物麻醉情況按0.2 g/kg肌內注射追加15 g/L戊巴比妥鈉。將小香豬背部剃毛，采用直線加速器照射脊柱兩側4 cm區域，創面照射劑量20 Gy。備皮打孔，形成直徑4 cm、深度為0.8 cm皮膚全層缺損。每頭小香豬單側2個創面，共4個創面，一側作為對照組接受假手術(A組，n=16)，另一側分別接受120 mm Hg持續負壓吸引(B組，n=8)和120 mm Hg間歇負壓吸引(C組，n=8)治療72 h后，觀察3個月。

1.3.2ADSCs分離與培養 采用0.5 mL/100 g肌肉注射速眠新對SD大鼠進行麻醉；用剃毛器去除腹股溝表皮毛發，局部消毒，切開皮膚，取皮下脂肪組織；用生理鹽水和PBS液沖洗脂肪組織塊3次，以洗去血跡；采用組織剪將組織塊攪碎，呈糊狀；將濃度為0.075%的2～3倍體積Ⅰ型膠原酶加入攪碎的組織塊中消化60～90 min；然后用50目的濾網過濾脂肪組織，濾液進行1 000 r/min離心10 min；棄上清液，得到的細胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基溶液重懸；調整細胞濃度為1×105/mL，接種于25 cm2培養瓶中；37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養；24 h后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后根據細胞生長情況，每3天換1次液，待細胞達到80%融合時用 0.25%胰酶消化傳代，隔天換液；倒置相差顯微鏡觀察記錄培養細胞生長情況。本課題組前期工作已對該方法提取的ADSCs進行了鑒定，因此本文未進行進一步探討[6]。

1.3.3Transwell遷移實驗 將細胞制備成單細胞懸液，計數并調節細胞濃度，將Transwell上室加入20 000個細胞，下室加入含1%血清培養基，使用不同負壓模式作用于Transwell小室。在孵箱中靜置8 h后，使用棉球輕輕將膜上層未遷移過去的細胞擦掉，倒置晾干；使用0.1%結晶紫室溫染色30 min；細胞進行染色后用PBS清洗，晾干；在顯微鏡下挑選5個視野，拍照并計數。

1.3.4細胞活性檢測 將細胞消化計數，按一定密度接種至24孔板中，待細胞貼壁后，去除培養基，使用PBS清洗并加入無血清培養基，置于孵箱內孵育8 h后，將每孔中分別加入60 μL 的MTT溶液，然后置于孵箱中孵育4 h后輕輕吸掉培養基，再在孔中分別加入300 μL DMSO，置于搖床上搖5 min；在490 nm波長下使用酶標儀檢測吸光度(A)值。

1.3.5Western blot檢測 收集蛋白樣品，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣量為每孔20 μg，電泳過程中，跑60 V濃縮膠盡量保持1 h以上，110 V分離膠大概所需2.5 h，待溴酚藍跑至底部后，暫停電泳儀；200 mA下持續100 min電轉至PVDF膜上。5% BSA溶液中封閉1 h，TBST洗滌3次，將PVDF膜置于含有HIF-1α(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶1 000)的5% BSA中，4 ℃搖床孵育過夜，次日加入HRP抗體室溫孵育2 h，顯影。用Image J軟件(美國國立衛生研究院)進行灰度分析，結果以目的蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)平均吸光度值的比值表示。

2 結 果

2.1NPWT對難愈性創面愈合的影響 NPWT治療難愈性創面72 h后，A組肉芽組織較晦暗，B組和C組肉芽組織鮮紅，呈細顆粒狀。治療21 d后A組創面大小未見明顯變化，B組和C組創面明顯收縮，且C組愈合程度優于B組，見圖1。

A1～C1：負壓吸引72 h后小香豬創面圖；A2～C2：負壓吸引21 d后小香豬創面圖(A1、A2為對照組，B1、B2為持續負壓吸引組，C1、C2為間歇負壓吸引組)

圖1不同NPWT模式對難愈性創面愈合的影響

2.2NPWT對大鼠ADSCs遷移行為的影響 采用Transwell法檢測不同負壓創面治療模式作用ADSCs 8 h后遷移變化情況，結果顯示：B組、C組與A組相比，ADSCs細胞遷移數量增加且差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；B組與C組相比差異有統計學意義(P<0.01)，且遷移數量低于C組，見表1、圖2。

A：對照組；B：持續負壓吸引組；C：間歇負壓吸引組

圖2不同NPWT模式對大鼠ADSCs遷移行為的影響(×100)

A：對照組；B：持續負壓吸引組；C：間歇負壓吸引組

圖3不同NPWT模式對大鼠ADSCs增殖行為的影響

2.3NPWT對大鼠ADSCs增殖行為的影響 采用MTT法檢測不同負壓創面治療模式作用ADSCs 8 h后細胞增殖變化情況，結果顯示：B組、C組與A組之間ADSCs細胞增殖差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖3。

2.4Western blot檢測大鼠ADSCs HIF-1α表達 經與內參GAPDH對比后，B組(0.62±0.09)、C組(1.39±0.27)與A組(0.47±0.07)相比HIF-1α表達增加且差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；B組與C組相比差異有統計學意義(P<0.01)，且HIF-1α表達低于C組，見圖4。

表1 不同NPWT模式對大鼠ADSCs遷移、增殖行為的影響

a：P<0.05，b：P<0.01，與A組比較；c：P<0.01，與C組比較

A：對照組；B：持續負壓吸引組；C：間歇負壓吸引組

圖4 HIF-1α在ADSCs中的表達

3 討 論

NPWT是近年來創立并開展的創面治療新方法，被廣泛應用于各種急性或慢性復雜難愈性創面，我國最早由裘華德教授引進并改良后應用于骨科和普通外科患者。NPWT可避免化學藥物治療可能引起的不良反應，較常規開放式換藥，具有創面愈合快、感染率低、更換敷料次數少等優點，但其促進創面愈合的確切作用機制尚未完全清楚[1,7]。NPWT可分為持續負壓吸引、間歇負壓吸引及變壓負壓吸引，目前臨床常采用持續負壓吸引，這種治療模式的優點是簡單方便、易操作，而歐美負壓創傷治療學會的基礎理論研究顯示：間歇負壓吸引更加有利于肉芽組織再生，加速創傷愈合過程，本研究采用不同負壓吸引模式治療結果顯示，間歇負壓吸引組創面愈合效果明顯優于對照組和持續負壓吸引組，這與同類型研究結果相吻合[8-9]。

ADSCs作為一種存在于人或動物不同部位脂肪組織中的“種子細胞”，可明顯加快全程皮膚組織切除后的創面愈合及糖尿病創面等難愈創面的修復，此外，ADSCs在創面局部微環境下可以誘導分化為創面修復所必需的成纖維細胞、血管內皮細胞和角質層細胞[10-11]。盡管ADSCs在創面愈合過程中發揮著極其重要的作用，但ADSCs異體或自體移植仍面臨生物安全性等諸多問題，且該細胞的遷移能力差，因此尋找合適的方式提高ADSCs的遷移能力和修復功能顯得至關重要[10]。HIF-1α是缺氧環境密切相關的蛋白，其介導的缺氧信號傳導是調節細胞遷移的重要機制，相關研究證實HIF-1α蛋白表達變化與ADSCs細胞遷移能力關系密切[12]，而NPWT能誘導HIF-1α表達上調[13]，由此推斷NPWT可通過增加HIF-1α蛋白水平表達促進ADSCs遷移，進而加速皮膚創面組織修復，縮短創面愈合時間。

本研究通過采用持續負壓吸引和間歇負壓吸引兩種不同NPWT模式治療小香豬難愈性創面，發現不同負壓吸引模式在創面愈合過程中存在著差異，且間歇負壓吸引更加有利于創面組織修復。進一步研究發現持續負壓吸引組、間歇負壓吸引組與對照組相比ADSCs細胞遷移數量增加，且間歇負壓吸引組優于持續負壓吸引組；為排除因細胞增殖而導致的遷移差異，采用MTT觀察遷移過程中ADSCs生物活性，結果顯示持續、間歇負壓吸引均對ADSCs細胞增殖無顯著影響。分析負壓吸引后蛋白表達變化發現，間歇負壓吸引可增加HIF-1α蛋白水平表達，以往有研究證實，HIF-1α受氧分壓的調控，能在缺氧條件下穩定表達[14]。

綜上所述，本研究揭示了NPWT通過上調HIF-1α蛋白水平表達，誘導ADSCs細胞遷移，進而調控創面修復。NPWT促進ADSCs細胞遷移可能成為創面修復潛在治療靶點，為NPWT用于難愈性創面治療的深入研究提供理論依據。

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Effectofnegative-pressurewoundtherapyonadipose-derivedstemcellsmigrationbehavior*

LiXiaoming1,LiuPing1,WangChao2,YangJiajia1,YaoShicai2,ZhangBo1△

(1．InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042;2．PediatricIntensiveCareUnitAffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity/KeyLaboratoryofChildDevelopmentalDiseases,MinistryofEducation,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo investigate the effect of negative-pressure wound therapy (NPWT) on the migration behavior of rat adipose-derived stem cells (ADSCs).MethodsEight(20±2)kg Bama miniature pigs respectively received the sham operation (group A,n=16),continuous negative pressure suction (group B,n=8) and intermittent negative pressure suction (group C,n=8).The pigs were observed for 3 months after 72 h treatment.The effect of NPWT on the migration behavior of ADSCs was observed at the cellular level.In order to avoid the influence of serum-free on cell viability,ADSCs were extracted and treated with continuous negative pressure suction or intermittent negative pressure suction for 8 h.The migration ability of ADSCs was detected by transwell.The proliferation ability of ADSCs was detected by MTT.The expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) was detected by Western blot.ResultsThe wound healing effect of continuous negative pressure suction group and intermittent negative pressure suction group was better than that of the control group,and compared with the control group,the number of migrating ADSCs cells had statistically significant difference (P<0.05,P<0.01),but cell proliferation had no statistically significant difference.The expression of HIF-1α was consistent with the migration results of ADSCs.ConclusionNPWT can promote the migration of rat ADSCs by up-regulating HIF-1α protein expression.

negative-pressure wound therapy;stem cells;migration

R649.9

A

1671-8348(2017)25-3463-03

2017-01-18

2017-06-06)

中國科學院-威高集團高技術研究發展計劃(ZKYWG2013-05)

李曉明(1988-)，碩士，助理實驗師，主要從事創傷修復、再生醫學研究。

△通信作者，E-mail:zhangbo67184@163.com。