泉州市部分海產(chǎn)品中霍亂弧菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及分析

莊月娥

(泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 362000)

泉州市部分海產(chǎn)品中霍亂弧菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及分析

莊月娥

(泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 362000)

對(duì)泉州市某區(qū)海產(chǎn)品中的霍亂弧菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，經(jīng)特異性試驗(yàn)表明：該方法能選擇性檢測(cè)O1和O139群霍亂弧菌，而且特異性好、靈敏度高，能有效克服假陽(yáng)性，結(jié)合傳統(tǒng)的病原微生物培養(yǎng)方法，可用于臨床檢驗(yàn)及衛(wèi)生檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該次送檢海產(chǎn)品檢出的2例O1霍亂弧菌均無(wú)毒力基因ctx，但仍需加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，預(yù)防散發(fā)和暴發(fā)流行。

霍亂弧菌；熒光定量PCR；檢測(cè)

Abstract:Vibriocholeraein some marine products in Quanzhou City was detected by real-time fluorescent quantitative PCR, the specificity test showed that this method could selectively detectVibriocholeraeO1 and O139 group with good specificity and high sensitivity, and effectively overcome the false positives, and had great guidance on the significance of clinical examination and health inspection combined with the traditional culture method of pathogenic microorganisms. The tested results showed that both two case of detectedVibriocholeraefrom tested marine products had no virulence genes CTX, but still needed to strengthen the monitoring to prevent distribution and outbreak of the disease.

Keywords:Vibriocholerae; fluorescent quantitative PCR; detection

霍亂是因霍亂弧菌污染而引起的一種急性腹瀉性傳染病，主要臨床表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水、死亡率高[ 1]，其中，O1和O139兩種霍亂弧菌的血清型能夠引起疾病暴發(fā)，其主要傳播途徑是通過(guò)水源或飲食經(jīng)口傳染。隨著熒光定量PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，許多由食源性病菌或者病毒引發(fā)的急性中毒都可以在很短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出來(lái)，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、污染少等優(yōu)點(diǎn)。因此，運(yùn)用熒光定量PCR等技術(shù)建立針對(duì)霍亂病菌污染防治的突發(fā)群體性公共衛(wèi)生事件應(yīng)急體系，以及開(kāi)展霍亂的流行病學(xué)和病原學(xué)研究具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1檢測(cè)樣本

由泉州市某沿海區(qū)疾控中心提供的咸水及淡水魚(yú)類、蝦類及貝殼類等水產(chǎn)品樣本60份。

1.2主要儀器與試劑

主要儀器為ABI 7500型定量PCR儀，O1 群和O139群霍亂弧菌診斷血清試劑，慶大瓊脂、TCBS等培養(yǎng)基，QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取試劑盒。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1增菌 在堿性蛋白胨水中，37℃增菌6～8 h。

1.3.2核酸提取 取增菌后的待測(cè)樣品1.0～1.5 mL至無(wú)菌離心管，8000 r/min離心4 min，除去上清液，加入DNA提取液50 μL ，振蕩混勻后沸水浴5 min，13 000 r/min離心5 min；上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3檢測(cè)

(1)將PCR反應(yīng)液放置至實(shí)驗(yàn)室室溫平衡，融化后取Taq酶，測(cè)試反應(yīng)體系配制為：PCR反應(yīng)液22.5 μL+Taq酶0.4 μL 。

(2)加入模板：將事先保存在-20℃的樣品核酸提取物解凍，以13 000 r/min離心5 min。在每個(gè)PCR反應(yīng)體系中分別加入模板、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各2 μL，記錄相應(yīng)樣品號(hào)。

(3)上機(jī)擴(kuò)增、檢測(cè)區(qū)：反應(yīng)條件為95℃、3 min，1個(gè)循環(huán)；95℃、5 s，60℃、40 s(信號(hào)采集)，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為25 μL。對(duì)于多通道熒光PCR儀，信號(hào)采集時(shí)設(shè)定為Fam熒光素。

1.4霍亂弧菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

霍亂弧菌的分離培養(yǎng)及生化鑒定參照《霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS289-2008)和《霍亂防治手冊(cè)》(第五版)。挑取較大、透明、扁平、濕潤(rùn)且邊緣整齊的菌落, 分別與多價(jià)血清、O139診斷血清等診斷血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，同時(shí)以生理鹽水作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1分子檢測(cè)結(jié)果

2.1.1特異性檢測(cè) 對(duì)霍亂弧菌以及其他7個(gè)食源性病菌分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，霍亂弧菌檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其他細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。說(shuō)明該方法不會(huì)與其他食源性病菌的檢測(cè)發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)有良好的特異性。

2.1.2檢測(cè)結(jié)果 霍亂弧菌目前已被分為200個(gè)以上的血清群,只有O1和O139群能引起霍亂流行。本試驗(yàn)分為2個(gè)步驟，一是以O(shè)1和O139群霍亂弧菌特異性試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在O1和O139群霍亂弧菌；二是以第1個(gè)步驟的檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步建立以毒力基因?yàn)榘谢虻臒晒釶CR檢測(cè)方法，檢測(cè)是否含有毒力基因。結(jié)果顯示，60個(gè)樣本中只有2個(gè)樣本O1群霍亂弧菌與陽(yáng)性對(duì)照樣本出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，而其他菌株和空白對(duì)照均為無(wú)規(guī)則的平直曲線，無(wú)法讀取其Ct值，判定為陰性(圖1)。此外，檢測(cè)O1群霍亂弧菌的6個(gè)毒力基因ctx顯示陰性(圖2)。

圖1 霍亂弧菌的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 霍亂弧菌ctx基因的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果

在60份樣品中共檢出2株霍亂弧菌，檢出率為3.3%。將兩份陽(yáng)性樣本通過(guò)分離菌株革蘭氏鏡檢為G-弧菌，在暗視野下作活菌鏡檢呈流星狀運(yùn)動(dòng)，加入1滴霍亂免疫血清后運(yùn)動(dòng)停止。其中在pH值8.6的堿性蛋白胨溶液中生長(zhǎng)良好，6～8 h產(chǎn)生菌膜。在慶大霉素平板上呈中等大小、圓形、較扁平、半透明、光滑、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊、略帶灰色的菌落，中間顏色稍深，呈灰黑色。

氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，有動(dòng)力，分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，V-P試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陽(yáng)性。分離的2株菌株與霍亂弧菌O1多價(jià)診斷血清發(fā)生凝集，鹽水對(duì)照呈陰性。

3 討論

對(duì)于霍亂的日常監(jiān)測(cè)主要包括外環(huán)境的監(jiān)測(cè)以及疑似霍亂污染病人的監(jiān)測(cè)，水和海產(chǎn)品檢測(cè)是外環(huán)境的檢測(cè)重點(diǎn)，因其含有大量弧菌，若以傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測(cè)往往需要花費(fèi)大量時(shí)間用于霍亂弧菌和其他弧菌的鑒別。熒光定量PCR檢測(cè)方法的出現(xiàn)，為霍亂弧菌的日常監(jiān)測(cè)提供了一種全新的、更為高效便捷的檢測(cè)手段，在實(shí)際疫情應(yīng)急診斷應(yīng)用中，可縮短檢測(cè)周期，結(jié)果更為靈敏準(zhǔn)確。

據(jù)目前的資料顯示，霍亂大流行主要是由O1和O139群霍亂弧菌引起[2-3]?；魜y弧菌的分布較為廣泛，且具有季節(jié)性，其流行性主要取新決于不同水環(huán)境中霍亂弧菌的生長(zhǎng)情況?；魜y毒素(CT)是霍亂弧菌的毒力決定因子之一，本次外環(huán)境監(jiān)測(cè)點(diǎn)的生活污水中檢測(cè)出無(wú)毒力的O1群霍亂弧菌為非流行株，該菌一般不會(huì)引起爆發(fā)性流行性傳播。但有研究表明，產(chǎn)毒株和無(wú)毒株之間可以通過(guò)含編碼霍亂毒素基因的溶源性噬菌體(CTX5)進(jìn)行傳遞。所以適宜的海水環(huán)境中的無(wú)毒力霍亂弧菌也可能獲得毒素基因，具有引起爆發(fā)流行的潛在危險(xiǎn)[4]。

隨著社會(huì)的發(fā)展、人們生活水平的提高，對(duì)海產(chǎn)品的需求及貿(mào)易已不局限于沿海地區(qū)，各地衛(wèi)生和市場(chǎng)部門都應(yīng)引起重視，及時(shí)建立和完善日常準(zhǔn)入制度，采取有效手段，做好霍亂弧菌的病原學(xué)檢測(cè)，及時(shí)切斷感染源及傳染途徑，防止其通過(guò)感染海產(chǎn)品傳播，進(jìn)而控制疫情發(fā)生。

[1]羅朝晨，謝一俊，張靜.霍亂流行態(tài)勢(shì)及我國(guó)霍亂防控中存在的問(wèn)題[J].傳染病信息，2008，1(3)：153.

[2]THOMASJK, RONALDK T.Tcpf is a soluble colonization factor and protect iveantigen secreted by Eltor and classical O1 and O139 Vibrio Cholerae serogroups[J].InfectImmun,2005,73(8):4461-4470.

[3]PANGB, YANM Y, CUIZG, et al.Genetic diversity of toxigenic And nontox igenic Vibrio Cholerae serogroups O1 and O139 revealed byarray-based comparative genomic hybridization[J].JBacteriol, 2007, 189(13):4837-4849.

[4]闞飆，祁國(guó)明，劉延清，等.霍亂弧菌中存在不含霍亂毒素基因的噬菌體CTXΦ基因組[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1999,19(3):175-179.

(責(zé)任編輯：林玲娜)

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Real-timefluorescencequantitativePCRdetectionandanalysisofVibriocholeraeinsomemarineproductsinQuanzhouCity

ZHUNAG Yue-e

(QuanzhouMedicalTechnicalCollege,FujianProvince362000)

2017-05-28

莊月娥，女，1985年生，助教。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.06.005