組蛋白去乙酰化酶5下調(diào)SIX1的表達(dá)以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的研究

王加偉,許安東,朱云祥

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科,江蘇 揚(yáng)州,225000)

論著

組蛋白去乙酰化酶5下調(diào)SIX1的表達(dá)以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的研究

王加偉,許安東,朱云祥

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科,江蘇 揚(yáng)州,225000)

目的探討組蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況以及在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的機(jī)制。方法采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)HDAC5在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，分析HDAC5表達(dá)量與患者生存預(yù)后的關(guān)系。在細(xì)胞水平敲除HDAC5后，觀察細(xì)胞的增殖、遷移能力以及凋亡功能的變化。結(jié)果HDAC5在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)與生存預(yù)后較差顯著相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞系中,HDAC5通過調(diào)控SIX1影響細(xì)胞的增殖。結(jié)論HDAC5在結(jié)直腸癌組織表達(dá)有差異，與結(jié)直腸癌生存預(yù)后相關(guān)，并可通過調(diào)控SIX1的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖。

結(jié)直腸癌;組蛋白去乙酰化酶;SIX1;增殖

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate expression of histone deacetylase 5 (HDAC5) in normal and colorectal cancer (CRC) tissues and its mechanism.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of HDAC5 in CRC tissues.The relationship between HDAC5 expression content and survival prognosis was analyzed.Proliferation,immigration and apoptosis changes were observed after knockdown of HDAC5.ResultsPositive expression of HDAC5 in tumor tissue was related with poor prognosis of CRC patients,and HDAC5 could inhibit the LS174T cell proliferation by regulating the SIX1 expression.ConclusionOur results reveal that HDAC5 expression is variant in CRC tissues,and it is correlated with prognosis of colorectal cancer,and can affect cell proliferation by regulating the SIX1 expression.

KEYWORDS:colorectal cancer;histone deacetylase;SIX1;proliferation

結(jié)直腸癌是常見消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率隨年齡增長而逐漸升高，而遠(yuǎn)期生存率則逐漸降低，且男性發(fā)病率和死亡率相對(duì)于女性較高，總體發(fā)病率和死亡率逐年升高[1]。腫瘤早期無轉(zhuǎn)移的患者5年生存率80%～90%,而晚期轉(zhuǎn)移的患者僅為10%～20%[2]。腫瘤的根治性切除已經(jīng)明顯增加了患者的5年生存率，但是結(jié)直腸癌是一種具有高度特異性的惡性腫瘤，其在臨床病理特征、組織形態(tài)、免疫表型、治療效果以及生物學(xué)行為等方面存在較大差異，腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是患者重要的死亡原因[3-4]。

組蛋白的乙酰化與去乙酰化的平衡是調(diào)節(jié)DNA復(fù)制與修復(fù)、有絲分裂過程、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要機(jī)制。組蛋白的去乙酰化是去除賴氨酸殘基上乙酰基的作用，恢復(fù)組蛋白的正電性，增加組蛋白與帶負(fù)電的DNA間的吸引力，從而阻止轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件靠近啟動(dòng)子而達(dá)到抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用[5-7]。去乙酰化過度會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移、血管生成與分化、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)的抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制，從而引起腫瘤的發(fā)生，而去乙酰化這一反應(yīng)主要由去乙酰化酶催化[8-9]。作為Ⅱ型去乙酰化酶家族成員之一的去乙酰化酶5(HDAC5)[10],在急性髓性白血病[11]、骨肉瘤[12]、髓母細(xì)胞瘤[13]、肺癌[14]等腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)上調(diào)，且在髓母細(xì)胞瘤中,HDAC5的表達(dá)上調(diào)和該疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13],在結(jié)直腸癌中的也有相關(guān)報(bào)道[15-16]。作者設(shè)想HDAC5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)程度與腫瘤患者的預(yù)后是否相關(guān)，能否通過抑制HDAC5在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)來影響細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡功能。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及細(xì)胞培養(yǎng)

本研究中，患者蠟塊組織來自新華醫(yī)院結(jié)直腸癌診治中心(免疫組織化學(xué)芯片，包含180例患者樣本信息)。本實(shí)驗(yàn)通過了新華醫(yī)院倫理委員會(huì)，每位參與者都簽訂了知情同意書。研究中用到的細(xì)胞系(RKO,LOVO,HT29,SW48,HCT116,LS174T,SW480,SW620,293FT)均從中國科學(xué)院購買，培養(yǎng)條件是DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗，細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2條件下。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建和慢病毒包裝感染

HDAC5,SIX1敲除序列參考Sigma公司網(wǎng)站，插入PLKO載體中，與包裝質(zhì)粒PAPAX2和PMD2G共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收取上清病毒液離心后感染細(xì)胞，采用Puromycin (Sigma)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot

cDNA均由細(xì)胞中的總RNA(Trizol法)反轉(zhuǎn)錄獲得，使用SYBR Green Premix Ex Taq 試劑盒于ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)施定量PCR實(shí)驗(yàn)，試劑盒均買自Takara公司。

參考碧云天細(xì)胞裂解試劑盒(P0013B),裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA試劑盒(碧云天)進(jìn)行蛋白定量，取20 μg總蛋白,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移到NC膜上,5%濃度的牛奶封閉后，一抗(1∶1 000)稀釋后加入孵育,β-Actin作為內(nèi)參,二抗孵育后(2∶1 000),用 Milipol化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白強(qiáng)度。見表1。

表1 HDAC5的相關(guān)引物

1.4 免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用SP法，操作過程嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行，一抗購自Sigma公司，陽性對(duì)照使用由既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)的陽性組織，陰性對(duì)照使用PBS代替一抗。結(jié)果分析:棕黃色顆粒為陽性顆粒，根據(jù)染色強(qiáng)弱，染色強(qiáng)度評(píng)分為0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)以及3分(強(qiáng)陽性);根據(jù)染色百分比，染色百分比評(píng)分為1分(<25%細(xì)胞染色),2分(25%～50%細(xì)胞染色),3分(51%～75%細(xì)胞染色)，以及 4分(>75%細(xì)胞染色)，最后的免疫評(píng)分(IRS)為細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分和染色百分比評(píng)分的乘積。IRS 0～4分為陰性,IRS 5～12分陽性。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，圖片數(shù)據(jù)使用Graphpad處理。

2 結(jié) 果

組織芯片免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,HDAC5在結(jié)直腸癌組織中存在差異性表達(dá)，通過分析生存預(yù)后數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),HDAC5陽性的患者生存預(yù)后相對(duì)于陰性的患者較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HDAC5蛋白表達(dá)的陽性率與結(jié)直腸癌臨床分期、浸潤深度以及生長部位、性別等其他臨床特征無關(guān)，而Ⅲ期和Ⅳ期的陽性率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期(0.738∶0.545,P=0.011),見表2,圖1A、B。180位患者HDAC5組織芯片Kaplan-Meier生存曲線顯示，在80個(gè)月的隨訪中，高表達(dá)HDAC5的患者生存時(shí)間較低表達(dá)的患者顯著較短(P=0.002)。見圖1C。

A.腫瘤細(xì)胞的陰性染色;B.腫瘤細(xì)胞的陽性染色(200倍);C.180位患者HDAC5組織芯片Kaplan-Meier生存曲線圖1 HDAC5免疫組織化學(xué)結(jié)果

表2 HDAC5的陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

與同一臨床特征另一亞項(xiàng)比較,*P<0.05。

在本實(shí)驗(yàn)中心，所有的結(jié)直腸癌細(xì)胞系(RKO,LOVO,HT29,SW48,HCT116,LS174T,SW480,SW620)中檢測(cè)蛋白水平HDAC5的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),LS174T細(xì)胞系中的HDAC5表達(dá)水平明顯比其他細(xì)胞系高。將此細(xì)胞系感染HDAC5 knockdown病毒后發(fā)現(xiàn),HDAC5在mRNA和蛋白水平敲除效率均較好，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HDAC5敲低后SIX1的表達(dá)下調(diào)明顯，且敲除HDAC5后的細(xì)胞增殖明顯比對(duì)照組的細(xì)胞慢。見圖2。LS174T細(xì)胞系感染SIX1 knockdown病毒后，在mRNA和蛋白水平SIX1均得到了明顯的敲低，同樣細(xì)胞的增殖也明顯比對(duì)照組細(xì)胞慢。見圖3。

3 討 論

目前，結(jié)直腸癌作為世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制仍不明確，盡管根治性切除已經(jīng)很大程度上延長了患者的生存期，但腫瘤的早期癥狀不明顯，大部分腫瘤患者確診時(shí)已處于中晚期，無法通過手術(shù)或放化療達(dá)到根治疾病的目的，腫瘤的晚期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因[17]。組蛋白的乙酰化與去乙酰化的平衡影響著細(xì)胞的多項(xiàng)功能,HDAC5作為Ⅱ型去乙酰化酶家族成員之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，影響患者的預(yù)后。分析組織芯片免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),HDAC5蛋白表達(dá)量較高的患者的生存預(yù)后比蛋白低表達(dá)患者要短，進(jìn)一步綜合分析后發(fā)現(xiàn),HDAC5蛋白在結(jié)直腸癌Ⅲ期和Ⅳ期患者組織中的陽性率高于Ⅰ期和Ⅱ期的患者(0.738∶0.545,P=0.011)。

在8種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中檢測(cè)HDAC5的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),LS174T細(xì)胞中的HDAC5表達(dá)顯著高于其他細(xì)胞系，由此采用該細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的下游實(shí)驗(yàn)。采用293FT細(xì)胞包裝HDAC5 knockdown病毒后感染LS174T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，無論是mRNA水平還是蛋白水平,HDAC5的表達(dá)都顯著降低。當(dāng)HDAC5表達(dá)降低后，作者發(fā)現(xiàn)SIX1的表達(dá)水平也有所降低。通過進(jìn)行HDAC5knockdown穩(wěn)系的功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HDAC5 knockdown細(xì)胞的增殖明顯比對(duì)照組的細(xì)胞慢。作者構(gòu)建SIX1 knockdown的病毒，并感染LS174T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，mRNA水平和蛋白水平上,SIX1的表達(dá)均明顯降低，同樣細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIX1 knockdown的細(xì)胞的增殖比對(duì)照組慢。

A:結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系中HDAC5蛋白水平表達(dá)情況;B、C、D:LS174T細(xì)胞系感染HDAC5 knockdown病毒后,mRNA和蛋白水平的HDAC5和SIX1表達(dá)均比對(duì)照組明顯降低;E:采用Cell Counting Kit (CCK-8)試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖后發(fā)現(xiàn)，敲除HDAC5后的細(xì)胞增殖明顯比對(duì)照組細(xì)胞慢(*P<0.05,**P<0.01)。

SIX1是一種與果蠅正弦眼發(fā)育有關(guān)的基因，在人類組織中相對(duì)比較保守[18]。在多種器官的發(fā)育早期,SIX1的表達(dá)相對(duì)較高，但是在成人的組織器官中較低甚至是缺失[19]。Coletta等[20]發(fā)現(xiàn)SIX1可以通過上調(diào)Cyclin A1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，以及在橫紋肌肉瘤的轉(zhuǎn)移功能中起著重要的作用[21-24]。作者發(fā)現(xiàn)HDAC5在患者組織中高表達(dá)與預(yù)后較差相關(guān)，且HDAC5可以通過下調(diào)SIX1來抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖，為HDAC5抑制劑的研究和臨床應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[25-27]。

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Studyoninhibitionofcolorectalcancercellproliferationviadown-regulationofSIX1expressionofhistonedeacetylase5

WANGJiawei,XUAndong,ZHUYunxiang

(DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225001)

R 735.3

A

1672-2353(2017)17-001-05

10.7619/jcmp.201717001

2017-03-20

中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2012M511109)

朱云祥