一起牦牛病毒性腹瀉病原學診斷

馬吉云 （青海省創業發展孵化器有限公司 810003）

一起牦牛病毒性腹瀉病原學診斷

馬吉云 （青海省創業發展孵化器有限公司 810003）

青海省祁連縣某牦牛養殖場發生以腹瀉為主要特征的疾病，傳播迅速，發病率為100%，初步懷疑為牦牛病毒性腹瀉，為此采集了2腹瀉樣本，采用Trizol方法提取腹瀉糞便的總RNA，利用我們設計合成的引物采用RT-PCR方法進行病原檢測，結果得出這兩腹瀉樣本均擴增出病毒性腹瀉病原產物，測序結果表明該場犢牦牛腹瀉由牦牛病毒性腹瀉病原引起。

病毒性腹瀉；病原；牦牛

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV），又稱牛病毒性腹瀉/黏膜病毒 (Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus，BVDV/MDV），在分類學上屬于黃病毒科 (Flaviviridae），瘟病毒屬 (Pestivirus）BVDV感染牛后，能引起牛的多種臨床，如高熱，白細胞減少，沉郁，厭食，下痢，大量流涎，減奶以至停奶，消化道黏膜糜爛，壞死，胃腸炎，孕牛流產或產出崎形胎兒等[1-3]。目前，犢牛腹瀉已經成為危害養牛業的一種重要疾病，犢牛腹瀉主要癥狀表現為消化道病變，該病一年四季均可發生，尤以氣候交替的初春和夏秋季節多發，引起犢牛腹瀉的因素眾多，既有病毒、細菌和寄生蟲等病原引起的感染性因素也有由營養和環境原因造成的非感染性因素[4-5]。其中，病原微生物感染是造成犢牛腹瀉的重要原因，常見的引起犢牛腹瀉的病原主要有輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒而又以BVDV最為常見[6-7]，這幾類病原的臨床癥狀和病理變化及其相似，現場難以確診，需要進行試驗的檢測來進行確認。本試驗對青海省祁連縣某牦牛養殖場的兩腹瀉樣本進行BVDV的RTPCR檢測，從而確診了引起該場犢牛腹瀉的主要病原為BVDV，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本

樣本為兩份發病犢牦牛腹瀉糞便 (無菌采集），2017年3月采于青海省祁連縣某養殖場的3月齡發病犢牦牛，臨床表現為腹瀉，脫水，糞便呈灰白色或深綠色糞便，帶有血便。

1.2 試劑

BVDV oregonC24V，YAK毒株購自中國獸醫藥品監察所。IPTG、Amp、RT-PCR試劑盒、Trizol均購自寶生物工程有限公司，微量膠回收試劑盒購自北京天根試劑公司，DEPC試劑購自Sigema生物公司。

1.3 參考毒株

BVDV oregonC24V，YAK毒株購自中國獸醫藥品監察所。

1.4 引物設計與合成

參照NCBI上發表的BVDV毒株基因組序列比對結果，采用生物信息學軟件primer5.0設計一對引物，引物命名為F1，F2。引物由寶生物工程有限公司合成。

F15'AGGCTAGCCATGCCCTTAGTAG 3'，F25'TGTGCCATGTACAGCAGAGATT 3'。

1.5 RT-PCR及產物檢測

應用Trizol試劑盒稍加改動提取方法，提取腹瀉糞便及標準毒株的總RNA，以Random 6 mers為隨機引物，按照RT-PCR試劑盒書進行cDNA合成，產物作為cDNA為模板，以F1、F2作為引物進行PCR的擴增。PCR擴增反應體系為：10*PCR Buffer Ⅱ5ul， DNTP Mixture 2ul， F11.0ul， F2， 1.0ul，TaRaPa ExTaqTMHS，0.5ul，cDNA模板5ul，滅菌超純水 up to 50ul。擴增條件：PCR擴增條件為：94℃1min，94℃30s，56℃30s， 72℃30s， 總計 40 個循環， 72℃10min。 取 5μlPCR產物以5V/cm的恒定電壓于10g/L的瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 PCR產物的純化及測序

采用天根公司微量膠回收試劑盒純化PCR預期產物，純化產物送至生物工程 (上海）股份有限公司測序。

2 結果

電泳結果顯示，在PCR擴增產物電泳中標準毒株及糞便提取總RNA均擴增出約280bp的條帶，結果見圖。將擴增出的陽性產物送至生物工程 (上海）股份有限公司測序，測序結果表明，發病犢牛的病原為BVDV，其與NCBI上所登錄的BVDV序列同源性最高為98%，參見附圖。

附圖 BVDVPCR擴增結果

3 討論

(1）實驗室檢測結果結合臨床癥狀分析，本次祁連縣養殖場的犢牦牛腹瀉病是由牦牛BVDV和ETEC所致。

(2）2016年陳新諾等[8]對青藏高原地區4個省的牦牛腹瀉樣本進行BVDV病原流行病學調查，發現BVDV感染在青藏高原地區的牦牛中普遍存在。格松[9]對2014～2015年青海玉樹地區的血清學調查資料顯示，目前牛群存在BVDV較高的抗體陽性率，且已相當嚴重，并且有日益嚴重的趨勢。

(3）BVDV在牛群中的潛伏感染常常導致該病很難凈化。該病可以通過母牛垂直傳播，感染BVDV的母牛會出現產死胎及弱仔現象，嚴重影響規模養牛場的發展。首先加強對新購牛的檢疫，最好堅持自繁自養，對引進的犢牛一定要做好BVDV抗體檢測工作，及時淘汰BVDV陽性感染牛成為該病綜合防控的重要方法。血清抗體檢測呈陰性方可飼養。防治BVDV最有效的手段就是牛群凈化，將BVDV陽性牛逐步淘汰。同時，加強飼養管理，經常消毒，保持良好的環境衛生，經常清理養牛場的糞便，保持牛舍通風良好。該病重在預防，發病后目前主要采取對癥治療措施，及時補液防止脫水。

[1]劉亞剛,殷中瓊,劉世貴,等.牦牛病毒性腹瀉/粘膜病的防制研究[J].中國預防獸醫學報,2003,25(6):487-490.

[2]Heinz F X,Collet M Sprucely R H,et al.Family Flavored.In“Virus Taxonomy”.Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Virus”[M].Academic press.San Diego,2000:859-878.

[3]Collet M S,Wiskerchen M,Welniak E,et al.Bovine viral diarrhea virus genomic organization[J].Arch virol Suppl,1991,3:19-27.

[4]Bartels C J,Holzhauer M,Jorritsma R,et al.Prevalence,prediction and risk factors of en-teropathogens in normal and non-normal faeces of young Dutch dairy calves[J].Preventive Veterinary Medicine,2010,93(2/3):162-169.

[5]Izzo M M,Kirkland P D,Mohler V L,et al.Prevalence of major enteric pathogens in Australian dairy calves with diarrhea[J].Australian Veterinary Journal,2011,89(5):167-173.

[6]Soltan M A,Wilkes R P,Elsheery M N,et al.Circulation of bovine viral diarrhea virus-1 （BVDV-1）in dairy cattle and buffalo farms in Ismailia province,Egypt[J].Journal of Infection in Developing Countries,2015,9(12):1331-1337.

[7]Yong-Il Cho,Won-Il Kim,Siyuan Liu,et al.De-velopment of a panel of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for simultaneous detection of major agents causing calf diarrhea in feces[J].J.Vet.Diagn.Invest,2010,22(7):509-517.

[8]陳新諾,張朝輝,徐林,等.青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病學調查[J].動物醫學進展,2016,37(9):35-38.

[9]格松.青海省玉樹地區牛病毒性腹瀉病的血清學調查[J].中國動物保健,2016,18(7):10-11.

馬吉云 （1982-）男，青海省西寧市人，碩士研究生，研究方向：預防獸醫學。