幾種豬藍耳病檢測診斷方法比較分析

金福源 朱國良 （江蘇省蘇州市吳江區動物衛生監督所盛澤分所 215200）

夏曉潮 （廣東省茂名市林業有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國東 （江蘇省蘇州市吳江區動物衛生監督所黎里分所 215200）

幾種豬藍耳病檢測診斷方法比較分析

金福源 朱國良 （江蘇省蘇州市吳江區動物衛生監督所盛澤分所 215200）

夏曉潮 （廣東省茂名市林業有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國東 （江蘇省蘇州市吳江區動物衛生監督所黎里分所 215200）

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱藍耳病，主要引起豬的繁殖障礙以及各種呼吸系統癥狀，臨床上給養殖戶造成了巨大的經濟損失，為了更好的控制豬藍耳病的流行，本文從其診斷檢測方法入手，分析了目前檢測該病主要方法的優劣勢以及存在的問題，并對這些方法的使用條件進行說明，為診斷與控制該病的發生提供依據。

藍耳病；檢測；診斷方法；分析

豬藍耳病是近幾年比較流行的病毒性傳染病，給養豬業造成重大損失，如果能盡早發現本病，將大大提高豬群成活率，減少損失。這就要求提高診斷水平，但本病診斷方法中很多受檢測設備、人員操作和環境條件的影響，不能很好的應用于臨床實踐。為了提高對本病檢測技術的認識，本文針對當下主要豬藍耳病病原檢測技術進行分析，以便能更好的服務于實際生產。

1 豬藍耳病簡介

豬藍耳病又叫豬繁殖與呼吸綜合征，是一種能夠引起豬生殖系統和呼吸系統出現機能障礙的病毒性傳染病，首次病例于1987年被發現于美國，近幾年來由于病毒的不斷變異，對控制和撲滅本病提出更嚴峻的挑戰。母豬發病后主要表現流產、死胎以及木乃伊胎等嚴重的繁殖障礙，斷奶仔豬普遍發生肺炎、生長遲緩等。我國已將其列為二類傳染病，本病傳播迅速，不僅可以通過呼吸道感染，也可以垂直傳播。雖然根據發病癥狀和剖檢特征可初步作出診斷，但確診仍需做實驗室檢查。

2 本病的診斷技術

2.1 臨床診斷

本病因感染程度和病程不同，感染豬的表現差異性很大，根據患豬臨床表現和病理變化可作出臨床初步診斷。繁殖母豬感染后表現精神沉郁、厭食、發熱，妊娠后期發生流產、死胎、木乃伊胎以及弱仔，患豬耳背面、邊緣以及尾部皮膚發紫，皮下出現一過性血斑。組織病理檢查可見有間質性肺炎特征，另外對于臨床癥狀不明顯，缺少臨床癥狀的豬群，可參照荷蘭制訂的3項診斷指標，即死產至少20%以上，流產母豬至少為80%以上，斷乳仔豬的死亡率至少為26%以上；符合其中的兩項指標或兩項以上指標，即可做出初步診斷。

2.2 實驗室診斷

2.2.1 病毒分離與鑒定

病毒分離鑒定主要將感染豬的肺、死胎的腸、腹水、血清、母豬血液、鼻試子和糞便等發病部位進行病毒分離。將病料過濾處理后接種至豬肺泡巨噬細胞培養，并進行中和試驗鑒定病毒。傳統中和試驗比較簡單，但特異性和敏感性低，操作時間較長 (1周左右），不能檢出早期感染的抗體，有學者曾對此方法進行改進，即在血清和病毒的混合液中加入補體，最早可在接種后8d檢測出抗體，提高了此方法的敏感性。病毒中和試驗需要培養單層細胞或者飼養實驗動物，比較麻煩，較少應用于臨床診斷。

2.2.2 血清學診斷方法

血清學檢查方法是近些年應用比較多的診斷方法，尤其是藍耳病的亞臨床型和慢性型的出現后，本方法顯得更為重要，目前比較常用的主要有以下幾種。

(1）免疫過氧化物酶單層試驗 (IPMA）

IPMA法是最早報道用于檢測本病抗體的方法，由荷蘭中央獸醫研究所于1991年建立，是目前歐盟最常用的藍耳病診斷方法。為了調查藍耳病的流行情況，針對吳江地區的3個規模化豬場的105份血清進行IPMA法檢測，結果如表1所示。

表1 IPMA檢測豬藍耳病血清抗體陽性率統計

從表1中可以看出，本病歐洲型抗體陽性檢出率為11.43%(12/105），美洲型的抗體陽性檢測率為47.62%(50/105），說明IPMA法具有很好敏感性和特異性，但歐洲性的檢出率低于美洲型檢出率，可能是由于在病毒增殖過程中，CPE(觀察致細胞癌變作用）時間較長不易脫落，造成假陰性結果。該方法能在豬感染后6d～12個月的血清中檢測到抗體，其缺點是試驗結果主要靠主觀判斷，不能自動顯示，且操作步驟復雜，費用高，有時會出現假陰性，因而不適用于大規模檢測，在我國尚未廣泛使用。

(2）間接免疫熒光試驗 (IFA）

間接免疫熒光試驗 (IFA）首先在美國應用于藍耳病的診斷，與IPMA法相當，可在感染后2～3周檢測出抗體，已經成為歐美各國官方認可的權威檢測方法。本試驗以美洲株為抗原，采用96孔細胞培養板為載體，建立了間接免疫熒光抗體試驗 (IFA）法用于檢測本病在豬群中的抗體水平。共采取168份血清，同時結合ELISA方法進行對比，結果如表2所示。

表2 IFA法與ELISA法血清抗體檢測結果的比較

與ELISA法相比，168份血清中，IFA檢測的陽性率為41.67%(70/168），ELISA法的檢出率為 42.86%(72/168），兩者的符合率為91.67%((64+90）/168）。試驗證明，IFA具有良好的特異性和敏感性。但IFA法操作需要專業技術人員，且診斷結果滯后，費時費力，不能滿足疫病快速診斷的需求。

(3） ELISA法

表3 不同方法對豬藍耳病免疫抗體檢陽性檢出率 （陽性數/檢出數）

表4 本病熒光定量RT-PCR檢測檢測同一頭豬不同組織的結果統計

酶鏈免疫吸附試驗 (ELISA）主要用于檢測豬藍耳病病毒抗體，可測定出感染2周的病毒抗體。目前市場上已售有各種類型的ELISA試劑盒。本研究從規模化豬場共采集血清樣品50份，分別用ELISA、IPMA、VN和IFA4種方法檢測本病抗體，進行對比。檢測結果如表3所示。檢測結果顯示，通過ELISA法，在首免后第7天即可檢測出部分陽性抗體，而其他3種方法則是在第10天以后才檢測出陽性抗體，病毒中和試驗 (VN）敏感性相對其他3種方法較低，陽性檢測率僅為38%，且費時費力。通過本次試驗，4種方法中，ELISA方法具有敏感性、特異性高，抗原用量少，不需要特殊儀器，快速、經濟，結果便于長期保存等優點，適于短期內大批量血清樣品的檢測，更適合大面積推廣，已有很多國家將本方法列為常規檢測方法。

2.2.3 分子生物學診斷方法

分子生物學診斷方法主要為PCR反應，目前已被廣泛應用于藍耳病臨床樣品的檢測。主要PCR檢測方法有：RTPCR、實時熒光定量RT-PCR和TaqMan熒光定量RT-PCR等。根據PCR原理，參考基因庫中的豬藍耳病病毒的Nsp2基因保守區設計了一對引物，擴增目的片段為690bp，建立了一種通用RT-PCR方法，應用此方法對2011～2013年搜集的125份樣品進行檢測，同時結合ELISA法進行比較，結果表明，RT-PCR法檢出率為44.9%，ELISA法檢出率為42.54%，兩者的符合率達94.66%。此結果表明，該方法具有特異、敏感、重復性好等優點，可以應用于臨床發病檢測以及流行病學檢測。

在普通RT-PCR方法的基礎上進行改進，建立熒光定量RT-PCR，通過此方法檢測發病豬場的5頭病死豬的不同組織臟器，并對結果進行統計，如表4所示，同一頭豬的不同組織臟器的含毒量不同，各個組織含毒量由高到低大致為肺、淋巴結和肝，脾和腎，肌肉。肌肉檢測量雖高，但其中兩份樣本卻未檢出，原因可能在于有些病料中含毒量很低。上述結果進一步說明，熒光定量RT-PCR敏感性高于其他方法，能夠檢測到豬其他組織中的微量本病的RNA病毒，這對于豬肉的食品安全監管具有重要意義。

除了靈敏度高、特異性強、檢測病料組織多樣化等優點之外，與血清學診斷方法相比，PCR法還能夠區分高致病性藍耳病病毒與未發生變異的傳統藍耳病毒株以及野毒株，為凈化本病提供可參考的依據。

3 小結與討論

豬藍耳病是一個全球性問題，對世界養豬業造成重要影響，選擇合適的診斷技術至關重要。豬群中暴發本病時，我們所面臨的問題就是準確而又快速的給出診斷，根據診斷結果做出相應防治措施。具體到藍耳病而言，現有的多種豬藍耳病的診斷方法，有的方法靈敏度低、有的方法檢測時間久，有的方法成本高，有的方法需要特殊的實驗環境或者昂貴的實驗儀器設備，有的方法需要專業技術人員，各有優劣勢。對于我們廣大養殖戶和獸醫工作者來講，應根據自己實際情況，考慮不同方法所適用的情形，選擇適合自己的診斷方法來判定本場的藍耳病感染程度，將經濟損失降低到最低。