陸地棉葉片葉綠素含量與SSR標記的關聯分析及優異等位變異的挖掘

劉其寶，李黎貝，張馳，宿俊吉，魏恒玲，王寒濤，喻樹迅

（中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000）

作物遺傳育種·種質資源·分子遺傳學

陸地棉葉片葉綠素含量與SSR標記的關聯分析及優異等位變異的挖掘

劉其寶，李黎貝，張馳，宿俊吉，魏恒玲，王寒濤，喻樹迅

（中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000）

【目的】篩選與陸地棉葉片葉綠素含量性狀相關聯的分子標記，挖掘其優異等位變異及典型材料，為陸地棉分子標記輔助育種提供技術支持。【方法】在3年6個環境中，對185份陸地棉品種（系）組成的自然群體進行倒4葉葉綠素相對含量（soil and plant analyzer development，SPAD）的測定，每年分3個時期（打頂后0、10和 20 d）。采用 PowerMarker 3.25軟件計算各位點的多態性信息含量，以分析群體的遺傳多樣性。利用STRUCTURE 2.3.4軟件計算群體結構矩陣（Q），利用TASSEL 3.0軟件計算親屬關系矩陣（K），通過GLM（general linear model，Q）和MLM（mixed linear model，Q+K）2種方法，同時對SPAD與SSR標記進行關聯分析。依據計算的等位位點表型效應值，挖掘優異的等位變異及典型材料?！窘Y果】137對SSR多態性引物共擴增出355個等位變異，平均每對引物擴增到2.6個多態性位點，PIC平均值為0.67，變化范圍為0.01—0.95，高度多態性引物（PIC＞0.5）占85%，其中PIC最高的標記為HAU2146（PIC=0.95）和NAU2083（PIC=0.93）。當ΔK取得最大值時，K=2，因此，將185份陸地棉材料劃分為2個亞群。通過GLM方法共檢測到22個顯著性位點（P＜0.001），表型變異解釋率為5.28%—10.85%，平均為7.24%，貢獻率最高的等位變異位點是SWU0529a（R2=10.85%）和NAU998c（R2=10.48%）；通過MLM方法共檢測到17個顯著性位點（P＜0.01），表型變異解釋率為3.72%—8.58%，平均為4.72%，貢獻率最高的等位變異位點是SWU0923b（R2=8.06%）和SWU0662d（R2=6.74%）；2種方法共同檢測到的顯著性位點有12個，等位變異NAU998c在3個時期2種方法能同時被檢測到。通過等位變異的表型效應分析，找到2個增效效應最大的等位變異（HAU3318b和SWU0987b），利用找到的等位變異對材料進行篩選，獲得攜帶2個增效效應等位變異的材料53份，2個增效效應位點都未檢測到的材料有46份，統計結果顯示，在打頂后10和20 d 2個時期，53份材料的SPAD均值顯著高于46份材料的SAPD均值。【結論】檢測到12個與SPAD值相關的顯著性位點，并挖掘到2個增效效應優異等位變異，獲得攜帶優異等位變異的載體材料53份，獲得攜帶2個優異等位變異的典型材料1份。

陸地棉；葉綠素；SSR；關聯分析；優異等位變異

Abstract:【Objective】The objective of this study is to detect the SSR markers associated with leaf chlorophyll content and explore the alleles and their typical materials in upland cotton. The results will be helpful for molecular marker-assisted breeding.【Method】The natural population including 185 upland cotton accessions were planted at two different places in 3 years and the dataof leaf chlorophyll content were recorded at 3 stages (0, 10 and 20 days after topping) every year. In analysis the polymorphism information of population structure, Power Marker 3.25 software was used to estimate the polymorphism information content (PIC).The structure of the natural population was analyzed using STRUCTURE 2.3.4 software and the kinship was estimated using TASSEL 3.0 software. Then the data were associated with 137 SSR markers by GLM (general linear model, Q) and MLM (mixed linear model, Q+K). The superior alleles were exploited and the phenotypic effects of total alleles were found.【Result】 Totally 355 polymorphic alleles were found with 137 SSR markers and 2.6 alleles were revealed with each marker in average ranged from 0.01-0.95. The 85% of total alleles were highly polymorphic primers (PIC＞0.5). HAU2146 (PIC=0.95) and NAU2083 (PIC=0.93)kept the maximum PIC. According to the results of STRUCTURE software, K value was 2 when ΔK was the max so the cultivars were divided into 2 populations. A total of 22 alleles found by GLM method significantly at the level of P＜0.001 which explained 5.28%-10.85% of the phenotypic variance and the mean value was 7.24%. SWU0529a (R2=10.85%) and NAU998c (R2=10.48%)kept the max value. Meanwhile, 17 alleles were found by MLM method significantly at the level of P＜0.01 which explained 3.72%-8.58% of the phenotypic variance and the mean value was 4.72%. SWU0923b (R2=8.06%) and SWU0662d (R2=6.74%)kept the max value. A total of 12 alleles were revealed by GLM method and MLM method in common, and NAU998c was significantly at 3 stages by GLM and MLM methods. Two positive alleles (HAU3318b and SWU0987b) were revealed over the estimated phenotypic effects. The 53 carrier materials of two positive alleles kept higher SPAD value in average than the 46 materials carried none of two positive alleles in 10 and 20 days after topping.【Conclusion】A total of 12 alleles associated significantly with leaf chlorophyll of upland cotton were found, and then two positive superior alleles, 53 carrier materials and one typical materials were revealed.

Key words:upland cotton; chlorophyll; SSR; association analysis; superior allele

0 引言

【研究意義】棉花是中國重要的經濟作物之一，改善棉花光合作用和延緩棉花衰老是提高棉花產量的有效途徑。而葉片的葉綠素含量既能直接影響棉花的光合效率，也是衡量棉花衰老程度的重要指標[1]。有研究表明，植株衰老階段的葉綠素降解特征，是影響作物高產的重要指標之一[2-3]。因此，對棉花葉片葉綠素含量相關的QTL位點進行基因定位，挖掘其優異等位變異，對發展棉花高產育種具有重要意義。【前人研究進展】目前，連鎖分析已經應用于棉花葉綠素含量相關的QTL定位研究。SONG等[4]、SARANGA等[5]分別通過海陸雜交組合BC群體和F2群體各檢測到2個和7個葉綠素含量相關的QTL；宋美珍[6]用葉綠素含量等生化指標研究短季棉早熟不早衰的遺傳機制，發現早熟不早衰類型的親本的葉綠素含量高于早衰類型，并檢測到4個葉綠素含量相關的QTL；秦鴻德等[7]用四交分離作圖群體的 F2:3家系對棉花葉綠素含量進行分析，檢測到 3個與葉綠素含量相關的QTL，認為其遺傳效應以加性效應為主；張建等[8]在陸地棉重組近交家系F2:7群體中，檢測到4個與葉綠素質量分數相關的QTL；鄭巨云等[9]、戎福喜等[10]分別用陸地棉F2：3家系和海陸滲透系構建的群體各檢測到1個與葉綠素含量相關的QTL。【本研究切入點】近年來，關聯分析（association analysis）的方法被廣泛用于植物數量性狀QTL研究中，如擬南芥[11]、水稻[12]、玉米[13-14]等。與傳統的連鎖分析相比，關聯分析以自然群體為材料，構建周期短，可以檢測到同一座位的多個等位基因，定位精確[15-16]。NIE等[17]、SU等[18-20]通過全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）的方法對棉花相關農藝性狀進行了基因定位，表明在棉花中運用關聯分析對數量性狀進行基因定位是一種非常有效的方法。但是利用關聯分析對棉花葉綠素含量進行基因定位的研究仍鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以185份陸地棉品種（系）構成的自然群體為材料，選用137對多態性引物，對3年6個環境中的棉花倒4葉葉綠素相對含量進行關聯分析，并挖掘與葉片葉綠素含量相關的優異等位變異，以期為棉花分子標記輔助育種提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和田間種植

試驗選取185份陸地棉材料組成自然群體[20]（表1），于2013年和2014年在中國農業科學院棉花研究所安陽試驗站種植，各設置2個播期（春播和夏播），播種日期分別為2013年4月26日、2013年5月23日、2014年5月1日和2014年5月25日；2016年設置安陽和黃岡2個種植點，播種日期分別為2016年4月25日和2016年4月17日。試驗采用常規田間管理，完全隨機區組試驗設計，設置3個重復。

表1 185份陸地棉材料來源Table 1 The origin regions of 185 upland cotton accessions

1.2 表型數據調查

從棉花打頂后第一天開始，使用葉綠素計（SPAD-502Plus，Konica Minoita，Japan）測定 185份陸地棉材料倒 4葉的葉綠素相對含量（SAPD），每個重復材料每10 d測量一次，共測量3次（打頂后0、10和20 d）。具體測量方法為每個材料隨機選取5株，每株測量3次，取測量的平均值作為該材料的葉綠素相對含量。

1.3 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[21]提取棉花幼嫩葉片的基因組 DNA。從 CMD（Cottonmarker database）數據庫（http://www.cottonmarker.org）選取 137對均勻覆蓋陸地棉26條染色體的SSR引物[22]進行群體擴增，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系為模板DNA 30 ng、10×PCR buffer 1.0 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL、10 mmol·L-1SSR 引物 2 μL、5 U·μL-1Taq DNA 聚合酶，加 ddH2O 補足 10 μL。Taq聚合酶和dNTP均購自北京全式金生物技術有限公司。PCR反應程序為95℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 45 s，45 s，29個循環；72℃ 10 min；10℃保存。擴增產物用濃度 8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并參考張軍等[23]方法進行銀染。

1.4 數據統計和分析

1.4.1 SSR標記分析 根據 SSR擴增產物的電泳結果，用0，1讀帶法進行帶型統計，遷移率相同的帶記為1，無帶記為0；不同基因型，用小寫字母a、b、c等區分。

1.4.2 多態性信息含量（polymorphism information content，PIC）分析 根據SSR擴增產物的帶型統計結果，采用Power Maker V3.25軟件[24]計算各位點的多態性信息含量（PIC），并用Excel表格進行統計分析。

1.4.3 群體結構分析 采用STRUCTURE 2.3.4軟件[25]進行群體結構分析，同時計算每個材料的Q值（即第i個材料基因變異源于第K個亞群的概率），以備后續關聯分析。參數設置為：K值范圍為 1—10，重復10次；MCMC（Markov Chain Monte Carlo）的2個參數分別設為50 000次和100 000次。由于STRUCTURE軟件得的原始數據不能很直觀地確定 K值，因此，需要計算K值的對數變化率ΔK來更為準確地判斷K值[26]。通過 StructureHarves（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）在線工具[27]收集 STRUCTURE軟件產生的結果，并作ΔK的變化規律圖，以此確定合適的群體數目，同時得到該K值下的Q矩陣。

1.4.4 表型數據分析 采用R語言的ANOVA方法對表型數據進行描述性統計分析，運用 R語言的‘lme4’包[28]計算SPAD在3個不同時期的遺傳力。

1.4.5 關聯分析 運用TASSEL 3.0軟件[29]提供的一般線性模型（general linear model，GLM）和混合線性模型（mixed liner model，MLM）2種方法分別對 3個時期的SAPD均值和SSR標記進行關聯分析。GLM分析需要的Q矩陣來自STRUCTURE軟件的結果，MLM分析中需要的Kinship矩陣由TASSEL軟件計算得到。

1.5 優異等位變異的挖掘

參考 BRESEGHELLO等[30]的方法，通過等位位點與無效等位變異（null allele）相比較，判斷該等位位點的表型效應。SSR位點等位變異表型效應的計算公式為：

其中，ai代表第 i個等位變異的表型效應值，xij為攜帶第i個等位變異的第j材料性狀表型測定值，ni為具有第i等位變異的材料數目，Nk為攜帶無效等位變異的第k個材料的表型測定值，nk為具有無效等位變異的材料數目。若ai值為正，則認為該等位變異為增效等位變異，反之為減效等位變異[31]。

2 結果

2.1 表型數據分析

對185份陸地棉材料在3個時期（打頂后0、10和20 d）及各自6個環境中的SPAD進行方差分析（表2）。在3個不同的測定時期，SPAD的平均值分布范圍分別為46.50—55.01、46.02—55.80和42.90—52.86，標準差分別為2.45—3.63、2.51—4.94和3.10—6.91，極差分別為 13.07—19.50、13.17—21.67和 15.37—30.90。在各個測定時期內，6個環境的葉綠素相對含量均呈極顯著正相關（P＜0.01），說明葉綠素含量在多個環境下重復性較好。雖然3個時期SPAD平均值變化不大，但是標準差和極差都隨測著測定時期的推移依次增大，說明越到后期，棉花品種間葉綠素含量的差異越明顯。3個時期的偏度和峰度都比較小，符合近正態分布，可以用作后續關聯分析。3個測定時期性狀的廣義遺傳力分別為 62.76%、57.77%和62.66%，說明葉綠素含量的遺傳力穩定且比較高，受環境影響較小。

表2 3個時期不同環境下SPAD值統計表Table 2 The statistics of SPAD value in different environments of 3 stages

2.2 遺傳多樣性和群體結構分析

利用篩選出的137對多態性引物進行群體擴增，共檢測到355個等位變異，平均每個標記檢測到2.59個等位變異。其中HAU2146標記和NAU2083標記檢測到的等位變異最多，分別為12個和8個。多態性信息含量（PIC）可以用來衡量基因變異程度的高低，BOTSTEIN等[32]認為，當PIC＜0.25時，為低度多態性信息引物，0.25＜PIC＜0.50時，為中度多態性信息引物，PIC＞0.50 時為高度多態性信息引物。對 137對引物進行PIC分析，其平均值為0.67，變化范圍為0.01—0.95，PIC＞0.50的高度多態性引物有115個，占總量的83.94%。其中，PIC最高的標記為HAU2146（0.95）和NAU2083（0.93）。分析結果表明，所選研究群體的遺傳多樣性較高、SSR標記多態性較好。

用STRUCTURE2.3.4軟件對185份陸地棉材料進行群體結構分析，并計算相應材料的Q值。由于LnP(D)值隨K值的增大而逐漸增大（圖1-A），且沒有明顯的拐點，無法準確判斷K的取值，所以參照EVANNO等[26]的方法進行亞群數量的判定。在K=2時，ΔK有最大值（圖1-B），所以將材料分為2個亞群（圖1-C）。其中一個亞群包含95份材料（占總材料的 51%）；另一個亞群包含 90份材料（占總材料的 49%）。獲得的Q矩陣將作為關聯分析的協變量，以消除群體結構對關聯分析結果的影響。

圖1 185份陸地棉材料的群體結構Fig. 1 The population structure of 185 upland cotton accessions

2.3 SPAD與SSR標記的關聯分析

用TASSEL軟件的GLM方法和MLM方法，在打頂后0、10和20 d 3個時期，分別對185份材料的SPAD值和355個多態性位點進行關聯分析。

通過GLM方法（表3、圖2）分析關聯到22個與SPAD值顯著相關的位點（P＜0.001），-lg(P)的取值范圍為 3.04—5.69，表型變異解釋率為 5.28%—10.85%，平均值為 7.24%。貢獻率最高的位點是SWU0529a和 NAU998c，貢獻率分別為 10.85%和10.48%。其中變異位點NAU2083e在打頂后10和20 d都被檢測到，平均貢獻率為7.84%；變異位點NAU998c在0、10和20 d都被檢測到，平均貢獻率為8.86%。

通過MLM方法（表3、圖2）分析共關聯到17個與SPAD值顯著相關的位點（P＜0.01），-lg(P)的取值范圍為 2.09—3.73，表型變異解釋率為 3.72%—8.58%，平均為 4.72%。貢獻率最高的位點是SWU0923b和 SWU0662d，貢獻率分別為 8.06%和6.74%。其中變異位點NAU2083e和NAU998c可以在0、10和20 d被檢測到，平均貢獻率分別為4.31%和5.14%；變異位點CGR5258c可以在打頂后10和20 d被檢測到，平均貢獻率為3.96%；變異位點NAU2806a可以在打頂后 10和 20 d被檢測到，平均貢獻率為4.54%。

比較GLM方法和MLM方法的關聯結果，GLM方法關聯到22個顯著性位點，MLM關聯到17個顯著性位點，兩者同時關聯到的位點有12個（表4），僅在GLM方法下關聯到的位點有10個，僅在MLM方法下關聯到的位點有5個。其中變異位點NAU998 c在2種方法3個時期都被檢測到。

2.4 葉綠素含量相關的優異等位變異的發掘

對GLM方法和MLM方法共同關聯到的12個顯著性等位變異，分別計算其表型效應值，發掘與葉綠素含量相關的優異等位變異（表4）。在打頂后0、10和20 d 3個時期，12個變異位點表型效應的范圍不同，分別是-0.71—0.79、-2.54—2.55和-3.52—5.94。在打頂后0 d，有4個位點表現為增效效應，8個位點表現為減效效應，且增效效應和減效效應的效應值絕對值差別不大；但是，在打頂后10 d，增效效應和減效效應的位點各有 6個，其中增效效應最大的位點是HAU3318b（2.55）和SWU0987b（2.05），減效效應最大的位點是 NAU998c（-2.54）和 MGHES-73a（-1.74）；在打頂后20 d，增效效應和減效效應的位點也各有 6個，其中增效效應最大的位點是HAU3318b（5.94）和 SWU0987b（4.65），減效效應最大的位點是NAU998c（-3.52）和NAU2083e（-3.48）。

用 2個增效效應最大的位點（HAU3318b和SWU0987b）對材料進行篩選，并比較其在打頂后0、10和20 d 3個時期SPAD值的差異。檢測到HAU3318b和SWU0987b 2個增效效應位點的材料（ZX2）有53份，2個增效效應位點都未檢測到的材料（ZX0）有46份。ZX2和ZX0在打頂后0 d的SPAD均值差異不大（圖3-A），而在打頂后 10和20 d，ZX2的SPAD均值都顯著比ZX0的SPAD均值高（圖3-B、圖3-C）；根據材料的表型數據，在ZX2中篩選了一份典型材料——新棉33B，其SPAD值在3個時期分別為52.68（0 d）、55.15（10 d）和55.67（20 d）。說明陸地棉倒4葉在打頂后10 d已經出現衰老表型的差異，此時的SPAD值可以作為棉花品種衰老性狀的指標。同時，檢測到HAU3318b和SWU0987b是2個提高葉片葉綠素含量的優異等位變異，獲得攜帶2個優異等位變異的載體材料53份，獲得攜帶2個優異等位變異的典型材料一份。

表3 GLM和MLM方法關聯分析結果Table 3 Association analysis results by the GLM and MLM

圖2 GLM和MLM兩種模型下的Q-Q plot圖Fig. 2 Quantile-quantile plots of the GLM and MLM

表4 GLM方法和MLM方法共同關聯到的12個顯著性位點在3個時期的表型效應Table 4 Phenotypic effect of the 12 significant loci at 3 stages by the GLM and MLM

2.5 關聯分析結果與前人QTL定位結果的比較

結合前人葉綠素含量相關QTL定位的研究結果[4-10,33]，利用e-PCR程序[34]將統計得到的25對SSR標記和本研究得到的10對（2對SSR標記未能成功匹配）顯著性標記匹配到參考基因組[35]上（圖 4）。35對 SRR標記被匹配到 19條染色體上（A01、A02、A03、A06、A07、A08、A09、A10、A13、D01、D03、D05、D06、D07、D08、D09、D10、D11、D13）。與前人研究結果相比，本研究在5條新的染色體上發現了標記位點，即 A01（SSR標記為 NAU2083、NAU2092）、A02（SSR 標記為 NAU3318）、A03（SSR標記為NAU998）、A08（SSR標記為SWU0932）、A09（SSR標記為MGHES-73）。

3 討論

葉綠素是植物進行光合作用的主要物質基礎，是作物高產的重要指標。目前，關于棉花葉片葉綠素含量的基因定位研究的較少，為了從全基因組水平上定位與葉綠素含量相關的基因，本研究采用關聯分析的方法，用覆蓋棉花26條染色體的137對多態性SSR引物對棉花葉片葉綠素含量進行了基因定位，并挖掘其優異的等位變異及典型材料。

圖3 攜帶兩個增效等位變異的材料在打頂后0、10和20 d 3個時期的SPAD值Fig. 3 The SPAD of cotton materials carrying two positive alleles in 0, 10 and 20 days after topping

圖4 綜合前人研究與本研究的35對SSR標記的環形物理圖譜Fig. 4 Circus physical map of 35 SSR markers from this study and previous studies

本研究用篩選到的137對多態性引物，187份陸地棉材料中共檢測到 355個等位變異，根據BOTSTEIN等[32]的分類方法，137對引物中有83.94%的引物為高度多態性引物（PIC＞0.50），說明本研究的SSR引物含有豐富的遺傳信息并且所選群體的遺傳多樣性很好，有利于后續的關聯分析和發掘優異等位變異。由于環境對數量性狀的影響很大，高遺傳力有利于關聯分析結果的準確性[36]。本研究在3年6個環境下，分 3個時期對棉花倒 4葉葉綠素相對含量（SPAD）進行了測量，統計結果顯示，SPAD的廣義遺傳力在3個時期約為60%，遺傳力穩定并且比較高，這為提高關聯分析結果的準確性提供了有利條件。

為降低群體結構和親屬關系造成的假陽性結果[37]，本研究計算了Q矩陣和K矩陣，并同時用GLM方法和MLM方法進行關聯分析。分析結果顯示（表3、圖2），MLM方法關聯到的位點（17個）比GLM方法關聯到的位點（22個）要少，說明GLM方法的假陽性率高于MLM方法。但是，MLM方法和GLM方法共同關聯到的位點僅有12個，所以通過2種方法相互比較印證，也可以有效的減少假陽性結果。值得注意的是，不同變異位點在同時期的表型效應有差異，而且有的變異位點在不同時期的表型效應值差異很大，甚至是效果相反。如位點NAU998c在3個時期都表現減效效應，且絕對值不斷增大，而位點HAU3318b在打頂后0 d表現為減效效應，在打頂后10和20 d都表現為增效效應，絕對值也不斷增大。這種現象可能是由于葉綠素含量相關的基因在棉花葉片不同生育時期是特異性表達造成的，具體原因還需要進一步的科學研究。

本研究首次利用了關聯分析的方法對棉花葉綠素含量進行基因定位，將關聯分析結果與前人QTL定位結果進行比較發現，D05是標記較為集中的染色體，王鵬等[33]、鄭巨云等[9]分別在D05染色體定位到一個葉綠素b含量相關的QTL（qCb-D05-3，附近SSR標記為 NAU3252）和一個 SPAD值相關的 QTL（qSPAD1，附近SSR標記為NAU1221），本研究在這2個QTL間關聯到一個顯著性SSR標記NAU1185，而且與qSPAD1（NAU1221）相距僅大約2 Mb，說明這一區段附近很可能存在與葉綠素含量相關的基因位點，可以進行深入的分析驗證。

通過計算與SPAD顯著關聯位點的表型效應，本研究發掘了SPAD相關的優異等位變異HAU3318b和SWU0987b。在棉花育種改良工作中，可以直接選取含有優異等位變異的材料作為親本，有利于提高選擇效率。

4 結論

共獲得355個多態性位點，檢測到12個與陸地棉葉片葉綠素含量（SPAD）相關的顯著性位點。發掘2個可以提高棉花葉片葉綠素含量的優異等位變異HAU3318b和SWU0987b，獲得 53份攜帶2個優異等位變異的析料，獲得一份攜帶2個優異等位變異的典型材料，可用于陸地棉分子標記輔助育種。

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（責任編輯 李莉，岳梅）

Association Analysis of Leaf Chlorophyll Content with SSR Markers and Exploration of Superior Alleles in Upland Cotton

LIU QiBao, LI LiBei, ZHANG Chi, SU JunJi, WEI HengLing, WANG HanTao, YU ShuXun
(Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology,Anyang 455000, Henan)

2017-03-20；接受日期：2017-05-25

國家自然科學基金（31660409）、國家棉花產業體系（CARS-18）

聯系方式：劉其寶，Tel：17051007243；E-mail：liuqibao566@163.com。通信作者喻樹迅，Tel：0372-2562201；E-mail：yu@cricaas.com.cn