QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯質譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內酯殘留量

虞 冰，劉 莉，汪志威，齊沛沛，王新全，徐霞紅，王祥云(.金華市農產品質量綜合監督檢測中心，浙江 金華 3000； .省部共建國家重點實驗室培育基地浙江省植物有害生物防控重點實驗室農業部農藥殘留檢測重點實驗室 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江 杭州 300)

QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯質譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內酯殘留量

虞 冰1，劉 莉1，汪志威2*，齊沛沛2，王新全2，徐霞紅2，王祥云2
(1.金華市農產品質量綜合監督檢測中心，浙江 金華 321000； 2.省部共建國家重點實驗室培育基地浙江省植物有害生物防控重點實驗室農業部農藥殘留檢測重點實驗室 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

建立了超高效液相色譜- 三重四極桿串聯質譜測定草莓中2，4- 表蕓苔素內酯殘留量的方法。基于QuEChERS方法進行了凈化材料及其配比的優化，最終采用40 mg PSA 和40 mg C18的組合進行凈化。試驗結果表明，2，4- 表蕓苔素內酯在2.5～1 000 μg·L-1內線性良好，相關系數為0.999，其最低檢出限為5 μg·kg-1，定量限為20 μg·kg-1。在20、50、100和200 μg·kg-1添加水平下，對草莓空白樣品添加2，4- 表蕓苔素內酯，方法回收率為98.1%～110%，相對標準偏差為3.3%～5.4%，滿足農藥殘留分析方法的要求。應用本方法對市售的47個草莓樣品進行檢測，均為未檢出2，4- 表蕓苔素內酯殘留。

2,4- 表蕓苔素內酯； 超高效液相色譜- 三重四極桿串聯質譜； 草莓； 植物生長調節劑

1970年，Mitchell[1]首先從油菜花粉中提取到可促進植物生長的活性物質，命名為Brassins(蕓苔素內酯)，之后又有50余種天然蕓苔素內酯類化合物(brassinolide)及其類似物激素從大量物種的花、種子、根莖和葉中被分離出來，被統稱為蕓苔素甾醇(brassinosteroids，BRs)。在蕓苔素甾醇植物激素中，蕓苔素內酯類化合物因其活性最高而被廣泛應用于農業生產[2]。目前我國已登記的蕓苔素內酯主要有4種[3]，分別為2，4- 表蕓苔素內酯、22，23，24- 表蕓苔素內酯、28- 高蕓苔素內酯和28- 表高蕓苔素內酯。其中，2，4- 表蕓苔素內酯由于合成所需工業原料麥角甾醇易得，因此應用更為廣泛[4]。

草莓以其香味誘人、口感甜美、具有藥用價值以及高經濟價值的特點而廣受青睞[5]。2，4- 蕓苔素內酯的使用有助于提高草莓產量[6]，現已有相關產品獲得登記[7]。目前對蕓苔素內酯類化合物報道的檢測方法包括氣相色譜- 質譜法[8- 9]、高效液相色譜- 電化學檢測器[10]/熒光[11]/質譜法[12]。其中，氣相色譜- 質譜法主要用于鑒定，其靈敏度較差；而高效液相色譜- 電化學檢測器/熒光/質譜法主要采用苯硼酸、菲硼酸、萘硼酸、二茂鐵硼酸、9- 菲硼酸和2- 溴吡啶- 5- 硼酸等硼酸衍生試劑[11- 14]提高蕓苔素內酯的儀器響應值，確保靈敏度，但衍生過程前處理方法較為繁瑣，且衍生試劑通常活性較高難以長期保存。本試驗擬基于QuEChERs方法，結合超高效液相色譜- 三重四極桿質譜建立草莓中2，4- 表蕓苔素內酯殘留量的快速檢測方法，并對實際樣品進行檢測驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

采用超高效液相色譜儀LC- 30A(日本Shimadzu公司)和三重四極桿質譜聯用儀AB- SCIEX 4500(美國AB公司)；Masslynx 4.1軟件用于儀器控制、數據采集和結果分析。色譜柱為Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；臺式離心機(美國Thermo公司)；Filter Unit濾膜(0.22 μm，Agela Technologies公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；乙酸銨、甲酸(HPLC級，美國Tedia公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂等均為分析純，購自華東醫藥有限公司；PSA、C18、GCB凈化材料均購于Agela Technologies公司。

1.2 樣品前處理方法

萃取。稱取草莓樣品10.00 g(0.01 g)于50 mL離心管中，準確加入10 mL乙腈，渦旋1 min。加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液待凈化。

凈化。移取上清液1.5 mL于2 mL離心管中，加入40 mg PSA+40 mg C18，劇烈震蕩1 min后，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，準確吸取上清液0.5 mL至裝有0.5 mL水的2 mL離心管中，混勻，以0.22 μm濾膜過濾，待超高效液相色譜串聯質譜(UPLC- MS/MS)測定。

1.3 儀器分析方法

采用UPLC- MS/MS進行樣品中2，4- 表蕓苔素內酯的分析測定。色譜柱為Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為水和甲醇(1∶9，V/V)，其中水相含2 mmol·L-1乙酸銨和甲醇中含0.1%甲酸；流速為0.25 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

質譜條件。采用電噴霧離子源，多反應監測模式(MRM)，加熱溫度500 ℃，噴霧電壓5 500 V。該化合物的特征離子對有4對，其母離子- 子離子對及相應的碰撞能量和去簇電壓經方法優化后條件見表1，表中標注*子離子為定量離子。

表1 2，4- 表蕓苔素內酯的UPLC- MS/MS離子對及碰撞能量、去簇電壓

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

本試驗基于三重四極桿串聯質譜儀確立2，4- 表蕓苔素內酯的質譜條件，主要包括離子對選擇、碰撞能量和去簇電壓等參數優化。配制1.0 mg·L-12，4- 表蕓苔素內酯標準溶液，通過蠕動泵以7 μL·min-1的流速直接進入質譜進行分析。首先，在Q1 MS模式下，m/z為300～600的質量范圍內進行全掃描，結果發現，其母離子[M+H]+的質核比m/z為481.4。然后，在Product模式下，以481.4為母離子篩選子離子，在0～40 eV內，改變碰撞電壓獲得響應值較高的子離子依次為315.2，349.3，445.2和113.0。最后，在MRM模式下優化每對離子對的碰撞能量和去簇電壓(表1)。圖1展示了50 μg·L-12，4- 表蕓苔素內酯標準溶液經色譜- 質譜分析后得到的4對離子對的提取離子流色譜圖，響應值較高的離子對依次為481.4>315.2和481.4>445.2。通過分析草莓基質標準溶液也驗證這兩對離子對具有最高的響應值和較低的干擾，確定以481.4>315.2為定量離子，481.4>445.2為定性離子。

圖1 50 μg·L-1蕓苔素內酯標準溶液4組離子對的特征

2.2 樣品凈化材料的選擇和優化

QuEChERS[15]方法是近年來發展十分迅速的一種前處理方法，該方法的重要環節在于除雜吸附劑的選擇。本試驗首先開展了4種吸附劑組合，即PSA+C18、PSA+GCB、PSA+GCB+C18和GCB+C18，對草莓提取液凈化效果的比較。結果表明，當吸附劑使用量各40 mg時，對樣品色素的去除效果依次為PSA+C18≈PSA+GCB>PSA+GCB+C18>GCB+C18。同時在空白草莓樣品中添加200 μg·kg-1蕓苔素內酯后，比較4種吸附劑組合的回收率，結果表明，40 mg PSA+40 mg C18的填料組合凈化后蕓苔素內酯的回收率最高為103.8%，其余填料組合凈化后對蕓苔素內酯損失較大，其回收率僅為51.2%～63.7%，故選擇以PSA+C18的填料組合作為凈化材料。

在選定以PSA和C18組合作為凈化材料后，本試驗又比較了20、40、60和80 mg等4種不同用量對草莓提取液的凈化效果(表2)，20 mg添加水平草莓萃取樣品的顏色較紅，40、60和80 mg添加量凈化效果明顯優于20 mg；添加比例為40 mg時，繼續增加凈化材料比例對樣品去色效果不明顯。

同時，評價了4檔凈化材料添加后草莓中2，4- 表蕓苔素內酯在200 μg·kg-1的添加回收率，結果顯示，回收率在95.3%～111.0%，能滿足檢測要求。本方法最終以40 mg PSA+40 mg C18作為草莓樣品提取液的凈化材料。

表2 2，4- 表蕓苔素內酯各前處理方法的回收率

2.3 線性、靈敏度、基質效應和方法回收率

配置2.5、5、10、25、50、100、250、500和1 000 μg·L-12，4- 表蕓苔素內酯的溶劑標準溶液和草莓基質標準溶液，以定量離子對481.4>315.2響應值對標樣濃度繪制標準曲線。試驗結果表明，在2.5～1 000 μg·L-1，溶劑標線性擬合方程為Y=2423.8X+10 250，相關系數r為0.999，其中Y為峰面積，X為標準溶液濃度；在2.5～1 000 μg·L-1，基質標線性擬合方程Y=1 866.1X+16 545，相關系數r為0.999。以兩組標準曲線擬合方法的斜率比值作為基質效應判定的依據，結果表明，草莓萃取樣品經本方法凈化后的基質效應為0.77，基質效應表現為抑制，因此采用基質標準溶液外標法進行定量。

該方法對2，4表蕓苔素內酯在草莓樣品中的最低檢出限以3倍信噪比計為5 μg·kg-1，最低定量限以10倍信噪比為20 μg·kg-1。在草莓空白樣品中添加適當體積的2，4- 表蕓苔素內酯標準溶液，使樣品中添加濃度分別為20、50、100和200 μg·kg-1，靜置30 min，使藥液被草莓樣品充分吸附，隨后按照1.2節的前處理方法和1.3節的儀器條件進行方法驗證，回收率和相對標準偏差見表3。結果表明，本方法對草莓中蕓苔素內酯在定量限濃度(20 μg·kg-1)，中等濃度(50和100 μg·kg-1)和高濃度(200 μg·kg-1)的加標回收率在98%～110%，完全滿足方法檢測需要。

表3 不同添加水平下草莓中2，4- 表蕓苔素內酯的回收率和相對標準偏差

2.4 實際樣品驗證

以本方法對47個市售草莓樣品進行檢測，均未檢出2，4- 表蕓苔素內酯殘留。

3 小結

本研究建立了草莓樣品中2，4- 表蕓苔素內酯殘留量的QuEChERs- 超高效液相色譜- 串聯質譜的快速檢測方法。對PSA、C18和GCB等凈化材料組合和用量進行了比較優化，最終采用40 mg PSA和40 mg C18作為凈化材料組合。本方法前處理簡單、靈敏度高，線性范圍、準確度和精密度均可滿足農藥殘留檢測的要求。

[1] MITCHELL J W，MANDAVA N，WORLEY J F，et al. Brassins—a new family of plant hormones from rape pollen[J]. Nature，1970，225(5237)：1065- 1066.

[2] ZULLO，TEIXEIRAADAM M A，GüNTER. Brassinosteroid phytohormones：structure，bioactivity and applications[J]. Brazilian Journal of Plant Physiology，2002，14(3)：143- 181.

[3] 曹立冬，吳進龍，李友順，等. 蕓苔素內酯類化合物的合成與分析方法研究進展[J]. 農藥科學與管理，2016，27(9)：12- 19.

[4] 王廣聚，董服燦，董建軍. 24- 表油菜素內酯的合成及應用研究[J]. Pesticides，2001，40(6)：12- 15.

[5] WANG Z W，CANG T，QI P P，et al. Dissipation of four fungicides on greenhouse strawberries and an assessment of their risks [J]. Food Control，2015，55：215- 220.

[6] 陸劍飛. 蕓苔素內酯對4種水果經濟性狀和品質的影響[J]. 浙江農業科學，2014(7)：1032- 1035.

[7] 農藥科技信息網[EB/OL].[2017- 04- 18]. http：//www.chinapesticide.gov.cn/hysj/index.jhtml.

[8] ASAKAWA S，ABE H，KYOKAWA Y，et al. Teasterone 3- myristate：a new type of brassinosteroid derivative in lilium longiflorum anthers [J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry，1994，58(1)：219- 220.

[9] ABE H，TAKATSUTO S，NAKAYAMA M，et al. 28- Homotyphasterol，a new natural Brassinosteroid from rice (L.) bran[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry，1995，59(2)：176- 178.

[10] 曹立冬，楊晶，鄭麗，等. 高效液相色譜- 蒸發光散射檢測器檢測24- 表蕓苔素內酯原藥含量[J]. 農藥學學報，2014，16(1)：72- 77.

[11] GAMOH K，TAKATSUTO S，IKEKAWA N. Effect of separation of C- 24 epimeric brassinosteroids by liquid chromatography [J]. Analytica Chimica Acta, 1992：319- 322.

[12] HUO F，WANG X，HAN Y W，et al. A new derivatization approach for the rapid and sensitive analysis of brassinosteroids by using ultra high performance liquid chromatography- electrospray ionization triple quadrupole mass spectrometry.[J]. Talanta，2012，99(99)：420- 425.

[13] 劉國清，張洪彬，劉建平，等. 高效液相色譜法測定22s，23s，24R表高油菜素內酯[J]. 色譜，1995，13(4)：290- 291.

[14] 王明月，李建國. HPLC熒光法測定苦瓜中的2，4- 表蕓苔素內酯殘留[J]. 農藥，2009，48(9):662- 663.

[15] 劉亞偉，董一威，孫寶利，等. QuEChERS在食品中農藥多殘留檢測的應用研究進展[J]. 食品科學，2009，30(9)：285- 289.

(責任編輯：張瑞麟)

S668.4

：B

：0528- 9017(2017)09- 1538- 03

2017- 06- 18

國家自然科學基金(21607133)；浙江省公益技術應用研究(2016C32G4010122)

虞 冰(1986—)，女，浙江金華人，助理工程師，本科，從事農產品質量安全檢測研究工作，E- mail：563640286@qq.com。

汪志威，助理研究員，博士，從事農藥環境行為和殘留分析工作，E- mail：wangzhiwei1106@126.com。

文獻著錄格式：虞冰，劉莉，汪志威，等. QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯質譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內酯殘留量[J].浙江農業科學，2017，58(9)：1538- 1540，1545.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170912