白藜蘆醇通過上調結腸癌HCT116細胞內凋亡相關分子表達促進細胞凋亡

劉 瑩 蔣敦科 李素艷 井 潔 林瑤光

(廣西醫科大學第一附屬醫院老年消化內科，廣西 南寧 530021)

白藜蘆醇通過上調結腸癌HCT116細胞內凋亡相關分子表達促進細胞凋亡

劉 瑩 蔣敦科 李素艷1井 潔 林瑤光

(廣西醫科大學第一附屬醫院老年消化內科，廣西 南寧 530021)

目的探討白藜蘆醇影響結腸癌生物行為的機制。方法采用結腸癌HCT116細胞，采用體外CCK8實驗觀察白藜蘆醇對結腸癌HCT116細胞增殖的影響；采用TUNEL凋亡實驗觀察白藜蘆醇對結腸癌HCT116細胞凋亡的影響；采用實時定量PCR及Western印跡檢測與凋亡相關分子的表達。結果CCK8實驗結果顯示，相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，體外處理結腸癌HCT116 24 h后，隨著白藜蘆醇劑量(25、50、100 μmol/L)的逐漸上調，結腸癌HCT116細胞的活力逐漸下調。TUNEL凋亡實驗顯示，相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，白藜蘆醇50 μmol/L生理劑量可明顯上調結腸癌HCT116細胞的凋亡染色率。實時定量PCR 與Western印跡實驗顯示，在白藜蘆醇生理劑量(50 μmol/L)的處理下，相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，凋亡相關基因Bax和Bad的表達均上調。結論白藜蘆醇通過上調結腸癌HCT116細胞內凋亡相關分子表達促進細胞凋亡。

白藜蘆醇；結腸癌；凋亡

據最新研究顯示，每年有超過3 000萬人被診斷為結腸癌〔1〕。但其臨床癥狀不典型，發現時大多已進展至晚期。外科手術切除病變組織是目前治療結腸癌的主要手段〔2〕，但大多經外科治療的結腸癌患者，表現出較高復發及低預后〔3〕。白藜蘆醇是一種天然多酚，最開始在紅葡萄皮中被發現〔4〕，也存在于一些藥用植物中。目前，白藜蘆醇是一類廣泛應用的腫瘤預防試劑〔5〕。研究顯示，白藜蘆醇可延緩結腸癌患者生存率及腫瘤中位擴散時間，并且一定劑量白藜蘆醇可明顯抑制胃癌細胞的發生及發展〔6〕。白藜蘆醇在結腸癌防治及治療過程中的重要發現及白藜蘆醇在胃癌細胞中的實驗現象表明，白藜蘆醇可干預結腸癌細胞的發生與發展〔7〕。本文采用體外細胞分子生物學實驗，觀察生理劑量白藜蘆醇對人結腸癌細胞HCT116生物學的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、培養基與試劑 HCT116(購于美國模式細胞公司ATCC)，培養基DMEM、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS， Gibco公司)。雙抗——青鏈霉素，Trizol核酸裂解液，逆轉錄試劑盒，qPCR試劑盒(碧云天公司)，白藜蘆醇(美國Gibco公司)。參考相關的文獻資料〔6〕，給予不同的體外處理方法，并據此分成未經白藜蘆醇處理(對照組)，白藜蘆醇處理 25 μmol/L劑量組,白藜蘆醇處理 50 μmol/L劑量組(生理劑量)，白藜蘆醇處理100 μmol/L劑量組。

1.2八肽膽囊收縮素(CCK8)增殖檢測實驗 培養人結腸癌細胞，待其生長穩定后，消化細胞，提前1 d以30%密度接種于96孔板(Hyclone公司)。隨后5 d，每天以1∶10的比例加入CCK8試劑，37℃孵育2 h，吸取上清液，紫外分光光度儀測量450 nm下OD值。

1.3提取RNA 0.25% 胰蛋白酶收集對數期細胞，加入適量Trizol，冰上孵育15 min、12 000 r/min離心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于焦炭酸二乙酯(DEPC)水，保存于-70℃。

1.4實時定量PCR(qPCR) 提取總RNA反轉錄成cDNA,進行熒光定量PCR反應。反應條件：95 ℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s 40個循環，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法進行相對定量分析。

1.5TUNEL法檢測細胞凋亡 將細胞以70%～80%的密度提前1 d爬片，用生理劑量(50 μmol/L)白藜蘆醇處理4 h，固定，加入TUNEL反應液，光學熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡比率。

1.6Western印跡檢測 將細胞用生理劑量(50 μmol/L)白藜蘆醇處理4 h后，檢測Bcl-2相關X蛋白(Bax)和Bcl-2相關死亡促進因子(Bad)凋亡相關基因的表達。一抗：3'-3'磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)配置比例為1∶10 000，Bad及Bax為1∶200；二抗，GAPDH配置比例為1∶10 000、Bad及Bax為1∶5 000。

1.7統計學方法 應用Graph Pad6.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1白藜蘆醇可抑制結腸癌HCT116細胞增殖 體外處理結腸癌HCT116 24 h，相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，處理后的結腸癌HCT116細胞增殖開始出現顯著抑制，且抑制強度隨白藜蘆醇劑量的增加逐漸上調；致處理結腸癌HCT116細胞72 h，結腸癌HCT116細胞完全死亡。見圖1。

1)P<0.01圖1 白藜蘆醇對結腸癌 HCT116細胞增殖的影響

2.2白藜蘆醇可引起結腸癌HCT116細胞凋亡 見圖2。相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，白藜蘆醇可明顯上調結腸癌HCT116細胞的凋亡染色率。

2.3白藜蘆醇通過上調結腸癌HCT116細胞內凋亡相關分子表達以促進細胞凋亡 Realtime PCR結果顯示，在白藜蘆醇生理劑量(劑量50 μmol/L)的處理下，相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，Bax和Bad的表達均明顯上調，其中Bax上調(15±2.1)倍、Bad上調(12.3±1.2)倍。進一步Western印跡實驗顯示，在白藜蘆醇生理劑量(劑量50 μmol/L)的處理下，相比于未經白藜蘆醇處理的結腸癌HCT116細胞，Bax和Bad的表達條帶顏色均明顯較高。見圖3。

圖2 白藜蘆醇對結腸癌 HCT116細胞凋亡的影響

圖3 白藜蘆醇通過上調結腸癌HCT116 細胞內凋亡相關分子表達以促進細胞凋亡

3 討 論

外科手術是目前臨床治療結腸癌的主要方法〔7〕。腹腔鏡低創傷度、高視野范圍的臨床優勢，使得其越來越多地應用于臨床各科的手術治療中〔6〕。結腸癌經早期外科治療可顯著提升患者生存率及預后。但基于結腸癌臨床表現不典型、早期發現率低等特點，臨床上對于結腸癌的早期干預度較低，結腸癌發現時多半已有轉移〔8〕。研究表明，術后化療藥物，包括順鉑、多柔比星及博萊霉素等藥物具有明顯的消化系統(惡心，嘔吐)、血液系統(白細胞減少、血小板降低)的副作用〔9〕；并且，術后化療藥物的廣泛應用不能有效遏制結腸癌腫瘤細胞的復發。白藜蘆醇是一類提取于植物內的天然多酚類物質，主要存在于紅葡萄果皮中，在神經保護、促神經相關祖細胞分化、腫瘤預防及輔助治療等方面的作用逐漸被發現。前期有研究報道，肺癌、結腸癌、胃癌患者在使用放化療的同時聯合口服白藜蘆醇，可明顯延長患者的中位生存期，并提高3年、5年的生存率〔10〕。本研究結果表明，白藜蘆醇可抑制結腸癌HCT116細胞增殖，可引起結腸癌HCT116細胞凋亡，且通過上調結腸癌HCT116細胞內凋亡相關分子表達以促進細胞凋亡。

1Senicourt B,Boudjadi S,Carrier JC,etal.Neoexpression of a functional primary cilium in colorectal cancer cells〔J〕.Heliyon,2016;2(5):e00109.

2Liang X,Luo M,Wei XW,etal.A folate receptor-targeted lipoplex delivering interleukin-15 gene for colon cancer immunotherapy〔J〕.Oncotarget,2016;7(32):52207-17.

3Ogata K,Takamori H,Hmezaki N,etal.Gastrointestinal perforation during regorafenib administration in a case with hepatic metastases of colon cancer〔J〕.J Chemother,2016;20(1):1-3.

4Niedzwiecki D,Frankel WL,Venaok AP,etal.Association between results of a gene expression signature assay and recurrence-free interval in patients with stage Ⅱ colon cancer in cancer and leukemia group B 9581(Alliance)〔J〕.J Clin Oncol,2016;34(25):3047-53.

5Chu QD,Zhou M,Medeiros K,etal.Positive surgical margins contribute to the survival paradox between patients with stage IIB/C(T4N0)and stage IIIA(T1-2N1,T1N2a)colon cancer〔J〕.Surgery,2016;160(5):1333-43.

6Ediriweera DS,Kumarage S,Deen KI.Comparison of hazard of death following surgery for colon versus rectal cancer〔J〕.Ceylon Med J,2016;61(2):52-5.

7Tashiro Y,Murakemi M,Otsuka K,etal.Intrathoracic Hernia after total gastrectomy〔J〕.Case Rep Gastroenterol,2016;10(1):1-6.

8Chen HJ,Wei Z,Sun J,etal.A recellularized human colon model identifies cancer driver genes〔J〕.Nat Biotechnol,2016;34(8):845-51.

9Rizzuto A,Palaia I,Vescio G,etal.Multivisceral resection for occlusive colorectal cancer:Is it justified〔J〕? Int J Surg,2016;33(1):S142-7.

10Groom K,Penna M,Arul D,etal.Capecitabine-related liver lesions:sinusoidal dilatation mimicking liver metastasis〔J〕.Clin Case Rep,2016;4(6):545-8.

〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)18-4500-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.030

1 廣西醫科大學第二附屬醫院老年消化內科

劉 瑩(1977-)，女，碩士，主治醫師，主要從事老年消化疾病研究。