白細胞介素-17家族細胞因子參與調(diào)控糖尿病大鼠腎臟炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

李曉燕 高艷鳳 曹宏敏 陳慧娜

(安陽市人民醫(yī)院腎病科，河南 安陽 830011)

白細胞介素-17家族細胞因子參與調(diào)控糖尿病大鼠腎臟炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

李曉燕 高艷鳳 曹宏敏 陳慧娜

(安陽市人民醫(yī)院腎病科，河南 安陽 830011)

目的研究糖尿病(DM)大鼠腎臟組織中白細胞介素(IL)-17家族各成員的表達情況并探討其在炎癥反應(yīng)中的作用。方法采用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射(150 mg/kg)法建立DM大鼠模型，代謝籠收集大鼠24 h尿液，ELISA法測定大鼠24 h尿蛋白，全自動生化分析儀測定血液肌酐、尿素氮水平；應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法及Western印跡測定IL-17A、IL-17F mRNA、蛋白表達情況。結(jié)果與對照組大鼠相比，DM大鼠模型制作成功4 w時腎功能顯著下降，8 w腎功能下降更加顯著；腎臟IL-17A及IL-17F在4 w時轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均顯著升高，8 w時升高更加顯著；DM大鼠腎臟IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E表達水平與對照組無明顯差異。結(jié)論在腎臟炎癥反應(yīng)過程中起主要作用的是IL-17A及IL-17F，有可能成為改善DM腎病的有效靶點。

糖尿病腎病；炎癥反應(yīng)；白細胞介素17A；白細胞介素17F

糖尿病(DM)是目前導(dǎo)致腎衰竭的首要原因，新增的透析患者中45%以上為糖尿病腎病(DN)所致〔1〕。越來越多的研究顯示炎癥反應(yīng)在DN的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色〔2〕。白細胞介素(IL)-17是一種主要由T細胞分泌的炎癥因子，在器官移植、自身免疫疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔3～6〕。IL-17家族包含6種結(jié)構(gòu)同源的配體：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和 IL-17F，目前關(guān)于IL-17家族各分子在DN中的作用還有待進一步研究。本實驗觀察DM大鼠腎臟組織中IL-17A～F的表達情況并探討其在炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑與儀器

1.1.1動物 清潔級SD大鼠60只，雄性，體重160～210 g，平均(183±10.8)g，購自維通利華實驗動物技術(shù)公司，小鼠飼養(yǎng)和實驗嚴格遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機選擇20只為DN組。采用一次性腹腔注射枸櫞酸緩沖液配置的鏈脲佐菌素(STZ)溶液(150 mg/kg)建模〔7〕。對照組給予等量枸櫞酸緩沖液。注射后1 w測量大鼠空腹血糖(FPG)，F(xiàn)PG>11.2 mmol/L即為建模成功。

1.1.2主要試劑和儀器 STZ購自Sigma公司，抗GAPDH、抗IL-17A～F抗體均購自英國Abcam公司，引物合成由Invitrogen公司完成，熒光定量基因擴增儀為美國Bio-Rad公司CFX96型，紫外可見分光光度計為美國Thermo Scientific公司ND 2000C型，凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司Universal Hood Ⅱ型，生化分析儀為邁瑞B(yǎng)S-380型。

1.2標本采集 建模成功后分別在第4、8周末，CO2法處死大鼠15只，切開腹部取出腎臟，然后立即放入液氮中，繼而矢狀縱行剖開，分別置于-80℃冰箱凍存待做后續(xù)檢測。

1.3生化檢測 第4周、8周末分別將15只對照組和DN組大鼠置于代謝籠中收集24 h尿液，離心后取6 ml上清液，用ELISA法檢測24 h尿微量蛋白。大鼠處死后腹腔靜脈取血4～5 ml，全自動生化分析儀檢測肌酐及尿素氮。

1.4應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RF-PCR)檢測IL-17家族各分子mRNA表達情況 取出凍存的腎臟組織，使用Trizol Reagent提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度。引物序列IL-17A上游：TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA；下游：CTTTCCCTCCGCATTGACAC；IL-17B下游：CATACTCTTCCATTCGAGCGTAG，上游：CTCCTGCTTCTAGGCTGGTTG；IL-17C上游：CTCCTGCTTCTAGGCTGGTTG，下游：CCACCTGGCACTTCGAGTTAG；IL-17D上游：AGCACACCCGTCTTCTCTC，下游：GCTGGAGTTCGCACTGTCC；IL-17E上游：ACAGGGACTTGAATCGGGTC，下游：TGGTAAAGTGGGACGGAGTTG；IL-17F上游：TGCTACTGTTGATGTTGGGAC，下游：AATGCCCTGGTTTTGGTTGAA；GAPDH上游：GTGTAACCCATAACCCCCAAGA，下游：CACCAGCAGACCCTCAAGC。

逆轉(zhuǎn)錄方法參照M-MLV試劑盒操作程序進行。擴增反應(yīng)體系10 μl，反應(yīng)條件：94℃ 2 min預(yù)變性，94℃ 10 s變性，60℃ 20 s退火，72℃15 s延伸，共進行40個循環(huán)，最后一個循環(huán)后72℃ 10 min總延伸。選擇Houskeep gene GAPDH作為內(nèi)標，對目的基因進行均一化。目的基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法，將對照組標本內(nèi)目的基因表達水平設(shè)為1，對DN組標本內(nèi)目的基因表達水平進行標準化。

1.5蛋白質(zhì)印跡法 -80℃保存的腎組織每組各取約100 mg加入適量PBS，電子勻漿儀勻漿，10 000 r/min離心15 min，去上清后加入適量蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑混合物。4℃靜置30 min，每10 min漩渦振蕩器振蕩1次；10 000 r/min離心15 min取上清液，測定蛋白濃度并調(diào)整樣品濃度一致。電泳：上樣量30 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳2 h。濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電壓80 V，時間1 h。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，室溫振搖1 h。4℃下一抗(1∶3 000)孵育過夜；TBST洗膜，15 min×4次;室溫下二抗(1∶5 000) 孵育1 h，TBST洗膜，15 min×4次。混合等體積顯色液A 液和B 液，將顯色劑滴加到PVDF 膜正面，于凝膠成像分析儀上進行檢測。以GAPDH為內(nèi)參照，通過Image J軟件計算目標蛋白與GAPDH的灰度比值進行半定量分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件，兩組數(shù)據(jù)的比較采用Studentt檢驗或Mann-Whitney檢驗(均為雙尾)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠DM模型制作 STZ注射后5 d，大鼠死亡2例，其余DN組大鼠經(jīng)FPG驗證，均符合DM模型標準。

2.2各組大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮水平對比 DN組4 w時尿蛋白、肌酐、尿素氮水平顯著高于對照組，8 w時升高更加明顯(P<0.05)。見表1。

2.3大鼠腎臟IL-17家族各因子在轉(zhuǎn)錄水平的表達 與對照組相比(1.7±0.8，2.2±1.3)，DN大鼠IL-17A表達在第4、8周末均顯著升高(5.1±1.6，10.5±1.8，P<0.01或P<0.001);IL-17F表達在第4、8周末均顯著升高(4 w對照組1.1±0.3，DN組3.5±0.5；8 w：對照組1.0±0.3，DN組4.0±0.7，P<0.01)；與對照組(4 w:1.3±0.5,1.2±0.2,0.9±0.3,0.8±0.3;8 w：1.3±0.8,1.2±0.4,1.2±0.2,1.1±0.3)比較，DN大鼠腎臟IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E表達水平無明顯差異(4 w：1.6±0.5，1.5±0.4，1.1±0.2，1.3±0.3；8 w：1.7±0.8，1.6±1.4，1.4±0.2，1.5±0.4)。

2.4大鼠腎臟IL-17A及IL-17F在翻譯水平的表達 與對照組比較，DN組大鼠IL-17A、IL-17F蛋白在第4、8周表達均顯著升高；IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E蛋白表達無明顯差異。見圖1。

表1 各組大鼠尿蛋白、尿素氮、肌酐水平對比

與對照組比較：1)P<0.05;2)P<0.01

圖1 各組大鼠腎臟IL-17A及IL-17F蛋白的表達

3 討 論

DN是DM的一種致命性并發(fā)癥，其病理特點是腎小管及腎小球基底膜增厚、胞外基質(zhì)積聚、連續(xù)性系膜增生〔1〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約1/3的DM患者承受著DN的影響〔8〕。雖然進行嚴格的胰島素治療、限制蛋白質(zhì)攝入量、控制血壓等措施可以延緩DN的發(fā)生，但是卻不能從根本上逆轉(zhuǎn)這種疾病〔9〕。以往研究證實多種炎癥分子及細胞因子導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是DN主要發(fā)病機制〔10〕。最新研究顯示，對小鼠給予嚴格的生酮飲食(5%碳水化合物，8%蛋白質(zhì)，87%脂肪)可以逆轉(zhuǎn)輕微的DN〔11〕。雖然對于人類來說這種極端的飲食方式基本是不可能的，但是這項研究揭示了DN是可以通過靶向調(diào)控目標分子實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的。IL-17家族細胞因子由于其強大的促炎調(diào)控作用而受到關(guān)注〔12〕。它們可以誘導(dǎo)多種細胞因子表達，如IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-β、TNF-α以及趨化因子IL-8、MCP-1等。通過這些細胞因子及趨化因子，IL-17在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥反應(yīng)以及牛皮癬和多發(fā)性硬化癥中發(fā)揮作用。IL-17家族各成員都具有獨特的表達部位和方式。IL-17A和IL-17F由激活的T細胞分泌，并在炎癥反應(yīng)期間表達上調(diào)；IL-17B主要在表達在一些外周組織和免疫器官；IL-17C在炎癥反應(yīng)期間表達也會上調(diào)，但在一般情況下呈低表達狀態(tài)；IL-17D在神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌中高表達，IL-17F在多種外周組織中都呈低表達狀態(tài)〔12〕。本研究顯示，DM大鼠腎功能明顯受到損害；DM大鼠建模成功后4 w時IL-17A及IL-17F在翻譯水平表達均增高，8 w末升高更加顯著。說明IL-17A和IL-17F在DN的進展過程中很可能發(fā)揮重要作用。Tong等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)與野生型DM模型小鼠相比，IL-17A基因敲除DM模型小鼠的蛋白尿癥狀和腎間質(zhì)損害要輕，提示抑制IL-17的表達將改善DN的癥狀，甚至對其進行逆轉(zhuǎn)。而目前關(guān)于抑制IL-17A或IL-17F對于DN的作用還無相關(guān)報道。另外有研究顯示IL-17在腎臟可能通過TRAF6、NF-κb通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔14，15〕。進一步的研究可通過抑制IL-17A、IL-17F表達或抑制TRAF6、NF-κB通路，觀察對DM模型大鼠腎臟的影響及變化。

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〔2016-11-19修回〕

(編輯 徐 杰)

R587

A

1005-9202(2017)18-4489-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.025

李曉燕(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腎病和血液凈化研究。