益肺解毒方聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

趙 丹 牟海軍 畢紅霞 石寒冰 孫璽媛 趙學(xué)梅 蔣麗艷 宋 波 王紹清

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸二科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

益肺解毒方聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

趙 丹1牟海軍 畢紅霞 石寒冰 孫璽媛2趙學(xué)梅1蔣麗艷1宋 波1王紹清1

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸二科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

目的探討益肺解毒方聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響。方法(1)應(yīng)用血清藥理學(xué)方法制備益肺解毒方藥物血清。60只SD大鼠，分為低、中、高劑量組及空白血清組，每組15只。給予低、中、高劑量益肺解毒方煎劑及等體積生理鹽水灌胃3 d，然后腹主動(dòng)脈取血，制備益肺解毒方藥物血清。(2)應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)益肺解毒方含藥血清、順鉑及將兩者協(xié)同后對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用。益肺解毒方藥物血清組分為3個(gè)劑量組(低、中、高劑量組)、空白血清組、 順鉑組；聯(lián)合組(低、中、高劑量益肺解毒方與空白血清聯(lián)合順鉑)。將順鉑設(shè)為5個(gè)濃度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另設(shè)空白對(duì)照組、空白調(diào)零組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各組對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果低、中、高劑量益肺解毒方藥物血清對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖均具有抑制作用(P<0.05)，且劑量與抑制率呈一定量效關(guān)系。順鉑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖亦具有抑制作用，且隨著濃度的增高，抑制率逐漸增高，作用呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。中、高劑量益肺解毒方藥物血清與順鉑協(xié)同，協(xié)同指數(shù)>1.15，數(shù)據(jù)結(jié)果提示益肺解毒方可以協(xié)同順鉑增加其療效。而應(yīng)用低劑量益肺解毒方則與順鉑協(xié)同效應(yīng)為單純相加。結(jié)論益肺解毒方聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有協(xié)同增效作用。

益肺解毒方；順鉑；肺腺癌A549細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

肺癌發(fā)病率、死亡率均位于惡性腫瘤第一〔1〕，臨床主張采用綜合治療。本課題組自主研制益肺解毒方，其主要作用為補(bǔ)氣養(yǎng)陰以助正氣；解毒消癥以祛邪氣。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)此方可改善老年肺癌患者呼吸道臨床癥狀和體力狀況，提高生活質(zhì)量；與化療結(jié)合，臨床療效明顯增強(qiáng)，且不良反應(yīng)發(fā)生率較低，患者的依從性、耐受性較高〔2〕。但其作用機(jī)制尚不明確。本課題觀察益肺解毒方藥物血清聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠(北京維通利華有限公司)；人肺腺癌A549細(xì)胞(齊醫(yī)學(xué)院岳麗玲研究員贈(zèng))。益肺解毒方主要組成包括生白術(shù)、生黃芪、北沙參、石見穿、天冬、茯苓、石上柏、山藥、金雀根、重樓等藥物；胎牛血清(Hyclone)；順鉑 (購(gòu)于江蘇豪森藥業(yè))；F12培養(yǎng)基(Sigma)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；噻唑藍(lán)(MTT，Amresco)。

1.2方法

1.2.1益肺解毒方藥物血清制備 將60只SD大鼠編號(hào)，隨機(jī)分為高、中、低劑量組及空白血清組，每組15只。給藥劑量分別為96、48、24 g·kg-1·d-1及等體積生理鹽水。每日進(jìn)行兩次灌胃、持續(xù)灌胃達(dá)3 d。于末次給藥后2 h行腹主動(dòng)脈取血，血液于室溫下靜置45 min，離心15 min，然后將同組血清收集、混勻，置于恒溫(56℃)水箱中，滅活30 min，使用微孔濾膜(0.22 μm)行過(guò)濾除菌，然后進(jìn)行分裝，保存在-20℃冰箱內(nèi)。

1.2.2MTT法檢測(cè) 應(yīng)用MTT法檢測(cè)單獨(dú)應(yīng)用益肺解毒方藥物血清和順鉑人肺腺癌A549細(xì)胞增殖能力的影響及兩者聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)將益肺解毒方組分為3個(gè)劑量組(低、中、高劑量組)、空白血清組、 順鉑組、聯(lián)合組(低、中、高劑量益肺解毒方與空白血清聯(lián)合順鉑)。將順鉑設(shè)為5個(gè)濃度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另設(shè)空白對(duì)照組、空白調(diào)零組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各組對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白調(diào)零組OD值)/(空白對(duì)照組OD值-空白調(diào)零組OD值)×100%〔3〕。用對(duì)數(shù)法計(jì)算順鉑的半抑制濃度(IC50)。按照金氏公式〔4〕判斷兩藥協(xié)同效應(yīng)：拮抗、相加或增強(qiáng)。求q值，q=E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)〔5〕，E(A+B) 表示兩藥合用的抑制率；EA、EB為兩藥分別使用時(shí)的抑制率。若q值<0.85為兩藥聯(lián)合具有拮抗效應(yīng)；>1.15為兩藥聯(lián)合具有增強(qiáng)效應(yīng)；1.15～0.85為兩藥聯(lián)合具有相加效應(yīng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

空白對(duì)照組與空白血清組人肺腺癌A549細(xì)胞OD值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明空白血清作用于人肺腺癌A549細(xì)胞后，對(duì)其增殖無(wú)影響。低、中、高劑量組OD值與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。順鉑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖具有抑制作用，并在一定范圍呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。低、中、高劑量組及空白血清組與不同濃度順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率均較單純順鉑組提高。但空白血清協(xié)同順鉑組與順鉑組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低、中、高劑量益肺解毒方藥物血清聯(lián)合順鉑與單純順鉑組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。低劑量益肺解毒方藥物血清聯(lián)合順鉑組q值為0.91～1.13，提示協(xié)同效應(yīng)為單純相加。而中、高劑量益肺解毒方藥物血清聯(lián)合順鉑組q值多>1.15，提示協(xié)同效應(yīng)為增強(qiáng)，其中高劑量益肺解毒方藥物血清與順鉑協(xié)同增效作用最強(qiáng)。見表1，圖1。

表1 益肺解毒方對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖作用的影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖1 益肺解毒方聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

肺癌的病因及病機(jī)是正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)。正虛者又以氣虛及陰虛兩證型多見，約占80%〔6〕，實(shí)則氣滯、血瘀、痰阻、熱毒之病理變化。中醫(yī)認(rèn)為化療藥物是一種熱毒，化學(xué)治療是一種以毒攻毒的治療方法，耗傷正氣，損耗陰液，致機(jī)體氣陰兩虛，因此，確立了益氣養(yǎng)陰、清熱解毒的治療方法。該方針對(duì)肺癌的病因、病機(jī)和癥候特點(diǎn)制定，是長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的成果。先期聯(lián)合化療治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)益肺解毒方加化療組緩解率為31.82%，而單純化療組僅為15%，其病灶穩(wěn)定率為77.27%，而化療組為40%。化療組血液毒性不良反應(yīng)的發(fā)生率為28%，化療加中藥組為19%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率亦較化療組降低，1、2、3年生存率明顯提高，生存質(zhì)量評(píng)分亦明顯大于單純化療組〔2，7〕，表明益肺解毒方具有穩(wěn)定病灶，緩解癥狀，抑制腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，改善生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，提高生存率，而且其毒性低、不良反應(yīng)較少，與化療藥物協(xié)同具有顯著的增效減毒作用。益肺解毒方為一復(fù)方制劑，成分極其復(fù)雜，藥物經(jīng)煎煮及口服吸收等一系列變化，有的藥物是藥物本身物質(zhì)發(fā)揮作用，有的是通過(guò)代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用，機(jī)制不同。

因此通過(guò)直接提取中藥后得到的粗提取物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)并且進(jìn)一步做藥物評(píng)價(jià)并不科學(xué)準(zhǔn)確。血清藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法為先將藥物應(yīng)用于動(dòng)物，待藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)到達(dá)血液系統(tǒng)，取其血清，將動(dòng)物血清作為藥物源來(lái)進(jìn)行藥理學(xué)觀察〔8～10〕。本研究結(jié)果表明，益肺解毒方含藥血清可以抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，并且當(dāng)其與順鉑聯(lián)合后，抑制率較單純順鉑組明顯提高，表明兩者合用具有顯著協(xié)同增效作用。

1林 森.大數(shù)據(jù)解讀癌癥〔J〕.百科知識(shí)，2016；(8)：4-7.

2孫璽媛，梁雋婷，姜 梅，等.益肺解毒方對(duì)老年晚期肺癌患者生存質(zhì)量的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2012；39(11)：2176-8.

3朱達(dá)堅(jiān).姜黃素與伊立替康對(duì)結(jié)直腸癌lovo細(xì)胞的協(xié)同作用及其機(jī)制研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

4金正均.論 Lineweaver-burk直線化公式的應(yīng)用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1980；1(1)：3-5.

5陳紅專，孫 琛，俞靄瑤，等.賴氨酸鍺和環(huán)磷酰胺合用對(duì)小鼠S-180肉瘤抑制作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1991；7(1)：32-5.

6劉嘉湘.辯證治療原發(fā)性肺癌310例療效分析〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，1985；(10)：3-5.

7孫璽媛，梁雋婷，李 松，等.中醫(yī)辨證聯(lián)合第三代細(xì)胞毒單藥治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌22例〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(18)：4526-7.

8陳 寧，宋冬雪，凌 娜，等.中藥血清藥理學(xué)方法的研究進(jìn)展〔J〕.北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014；28(1)：40-3.

9陳 錢，黃成然，陳 凱，等.血清藥理學(xué)方法應(yīng)用的研究進(jìn)展〔J〕.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015；36(1)：65-8.

10林 慧，梅全喜.單味中藥及其復(fù)方制劑抗腫瘤血清藥理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥房，2016；27(4)：550-2.

〔2016-10-15修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R734.2

A

1005-9202(2017)18-4484-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.023

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(No.12541934)

1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 2 齊齊哈爾市第一醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科

牟海軍(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

趙 丹(1979-)，女，碩士，講師，主要從事病原與腫瘤研究。