依達拉奉對急性肺損傷大鼠肺組織凋亡的影響

劉月英 郭憲民 李 波 盧 佳

(香港大學深圳醫院，廣東 深圳 518000)

依達拉奉對急性肺損傷大鼠肺組織凋亡的影響

劉月英 郭憲民1李 波2盧 佳3

(香港大學深圳醫院，廣東 深圳 518000)

目的探討依達拉奉治療急性肺損傷(ALI)大鼠的作用及其機制。方法將48只清潔級Wistar成年大鼠隨機分為對照組、ALI組和依達拉奉(EDA)組，之后給予EDA治療。治療后第7天留取肺臟組織，行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織形態，Western印跡和免疫組織化學法檢測肺組織Bcl-2和Bax表達。結果HE染色顯示ALI組肺組織表現肺結構部分破壞，肺泡部分肺泡壁塌陷且水腫嚴重，部分肺泡腔擴大，大量炎性細胞浸潤，肺泡隔顯著增厚，明顯的局部出血；與ALI組相比，EDA組肺組織結構破壞較輕，水腫也明顯減輕，僅有少量炎性細胞浸潤。Western印跡結果顯示，與ALI組相比，EDA組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯增高，促凋亡蛋白Bax表達水平顯著降低，酶切-caspase3蛋白表達明顯下調(均P<0.01)。免疫組化結果表明，與ALI組相比，核漿中的Bcl-2表達水平明顯增高，Bax表達水平明顯降低(均P<0.01)。結論EDA在ALI大鼠肺組織中上調Bcl-2和下調Bax蛋白水平來降低細胞凋亡,同時其可能通過減少Caspase3依賴途徑的凋亡來保護肺組織。

急性肺損傷；依達拉奉；凋亡；脂多糖

細胞凋亡是一個被動的過程，分為外源性死亡受體通路，內源性線粒體通路和內質網應激引起的Caspase12活化通路3條途徑〔1〕。內源性線粒體通路為由線粒體外膜通透性增加引起Bcl-2家族蛋白改變〔2〕。這3條通路最后都會匯集到Caspase3，引起剪切的Caspase3活化導致細胞的死亡發生〔3〕。依達拉奉(EDA)是以陰離子存在血液中，通過吸取體內自由基轉移的單電子生成EDA基團，從而阻斷脂質過氧化反應，避免氧化損傷的產生。研究認為EDA可以消耗中性粒細胞生成的·OH和H2O2，破壞其產生活性氧的能力〔4〕。同時也有研究認為其可以抑制神經細胞的凋亡〔5〕。在缺血性腦病大鼠模型中，EDA能抑制急性腦水腫及神經功能的損壞〔6〕。前期研究發現通過改變Bcl-2和Bax蛋白的表達，來進一步的影響凋亡執行蛋白Caspase3的表達，而細胞中Bcl-2的高表達也能影響Caspase3蛋白的表達〔7〕。本研究以急性肺損傷(ALI)大鼠為研究模型，給予EDA治療，觀察肺組織形態學的改變和肺組織中凋亡相關蛋白的表達，進一步探討其對ALI的作用機制。

1 材料與方法

1.1藥品及主要試劑 脂多糖(美國 Sigma公司)，EDA注射液(國藥集團國瑞藥業有限公司)，Bcl-2、Bax和caspase3抗體及SP免疫組化試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.2實驗動物及分組 健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質量(250±10)g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。本研究選用一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射制造大鼠ALI模型。隨機分為ALI組和EDA組，之后選取一次性給予5 ml生理鹽水靜脈注射為對照組。對照組一次性灌胃1 ml生理鹽水；2次/d腹腔注射1 ml生理鹽水。ALI一次性給予5 mg/kg脂多糖靜脈注射。EDA組，一次性給予5 mg/kg脂多糖靜脈注射造模后，之后腹腔注射0.5 mg·kg-1·d-1EDA腹腔注射。治療7 d后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取肺組織-80℃保存。同時右肺中葉應用10%中性甲醛溶液予以固定48 h，之后進行脫水、浸蠟、包埋、切片等過程，最后給予蘇木素-伊紅(HE)染色。冷凍肺組織行蛋白質免疫印跡試驗。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.3HE觀察肺組織形態學 取肺組織切片，經脫蠟、HE染色、梯度乙醇脫水、透明、封固的陽性細胞光鏡下觀察。

1.4免疫組化 采用北京博奧森生物科技有限公司SP組化試劑盒。

1.5Western印跡檢測肺組織Bcl-2和Bax蛋白表達 提取肺組織總蛋白，Bio-Rad 法測定蛋白濃度，給予Western印跡實驗。顯色結束后，膜拍照封存，并做好記錄。用Image J圖像處理軟件計算各條豆類灰度值，分析Bax、Bcl-2和Capase3蛋白的表達情況蛋白的表達情況。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1HE染色結果 對照組大鼠肺組織結構清晰且肺泡壁厚度均勻，肺泡隔結構正常。ALI組肺組織表現肺結構部分破壞，肺泡壁塌陷且水腫嚴重，部分肺泡腔擴大，大量炎性細胞浸潤，肺泡隔顯著增厚，明顯的局部出血；與ALI組相比，EDA組肺組織結構破壞較輕，肺泡隔厚度降低，水腫也明顯減輕，僅有少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.2Western印跡法檢測急性肺損傷大鼠肺組織中凋亡相關蛋白的表達 與對照組相比，ALI組Bcl-2蛋白表達明顯降低、Bax蛋白表達明顯增高(P<0.01)；EDA組Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)，但是Bax蛋白沒有明顯變化。與ALI組相比，EDA組Bcl-2蛋白表達明顯增加，Bax蛋白表達明顯降低(P<0.01)，見圖2。對照組肺組織中酶切-Caspase3蛋白沒有表達，但在ALI組中明顯增高(P<0.01)，經過EDA治療后，酶切-Caspase3蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖1 EPI治療ALI大鼠肺組織HE染色(×40)

圖2 ALI大鼠肺組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達

圖3 Western印跡檢測急性肺損傷大鼠的 肺組織中Caspase蛋白的表達(×40)

2.3免疫組化法檢測ALI大鼠肺組織中Bcl-2和Bax蛋白表達結果 對照組Bcl-2蛋白在核漿中表達，在胞質和細胞膜中沒有表達，而Bax蛋白在正常的肺組織中沒有表達。ALI組核漿中Bcl-2的表達水平明顯降低，同樣在胞質和細胞膜中也沒有表達，Bax蛋白在核漿中的表達明顯增加，細胞質中表達水平明顯上調。在經過EDA治療后，Bcl-2在核漿中的表達水平明顯增高，同時在胞質中有少許的Bcl-2的表達。Bax在核漿中表達水平明顯降低，但是胞質中的Bax沒有表達，見圖4，5。

圖4 免疫組化檢測急性肺損傷 大鼠的肺組織中Bcl-2蛋白的表達(×40)

圖5 免疫組化檢測ALI 大鼠肺組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(×40)

3 討 論

ALI是指由感染、休克、化學性吸入和創傷等引起的彌漫性肺毛細血管內皮細胞和上皮細胞損傷所致的滲透性水腫和低氧血癥為主的臨床癥狀疾病。如果不及時治療，可能發展為急性呼吸窘迫綜合征〔7〕。如果外部刺激因素不變或內部影響因素不給予干預，通常會引起更快的病情進展。伍俊峰〔8〕也曾經用過脂多糖制作大鼠ALI模型，其通過檢測了大鼠的血氣分析相關指標和測量肺濕重等臨床指標來確認造模成功，之后也通過HE染色來確認大鼠肺組織出現水腫。

本研究結果說明在ALI大鼠肺組織中，細胞的凋亡水平為促凋亡大于抗凋亡，細胞表現為凋亡持續狀態。免疫組化法證明了ALI大鼠肺組織處于凋亡持續狀態。在經過EDA治療后，細胞的凋亡水平為抗凋亡大于促凋亡，細胞表現為抗凋亡狀態。說明EDA能提高細胞的抗凋亡水平。免疫組化法也證明依達拉奉對急性肺損傷大鼠肺的治療作用。研究發現了細胞可以通過改Bcl-2和Bax蛋白的表達，來進一步影響凋亡執行蛋白Caspase3的表達，而細胞中Bcl-2的高表達也能影響Caspase3蛋白的表達〔9〕。本研究結果說明EDA可以有效抑制ALI大鼠肺細胞凋亡的發生。

1Bhola PD,Letai A.Mitochondria-judges and executioners of cell death sentences〔J〕.Mol Cell,2016;61(5):695-704.

2Pandey MK,Prasad S,Tyagi AK,etal.Targeting cell survival proteins for cancer cell death〔J〕.Pharmaceuticals(Basel),2016;9(1):Pii:E11.

3Green DR,Llambi F.Cell death signaling〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol,2015;7(12):pii:a006080.

4Feng S,Yang Q,Liu M,etal.Edaravone for acute ischaemic stroke〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2011;7(12):CD007230.

5Yang J,Liu M,Zhou J,etal.Edaravone for acute intracerebral haemorrhage〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2011;16(2):CD007755.

6Higashi Y.Edaravone for the treatment of acute cerebral infarction:role of endothelium-derived nitric oxide and oxidative stress〔J〕.Expert Opin Pharmacother,2009;10(2):323-31.

7Millar FR,Summers C,Griffiths MJ,etal.The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome:insights and therapeutic opportunities〔J〕.Thorax,2016;71(5):462-73.

8伍俊峰.依達拉奉對脂多糖內毒素誘導急性肺損傷大鼠的保護作用及分子機制研究〔D〕.杭州：浙江大學，2009.

9楊 申.P38MAPK抑制劑對血管性癡呆大鼠海馬細胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表達及其學習記憶能力的影響〔D〕.濟南：山東大學，2013.

〔2017-03-25修回〕

(編輯 李相軍)

R332.2

A

1005-9202(2017)18-4482-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.022

吉林省衛生計生委(2015SZC13)

1 吉林大學第一醫院 2 吉林大學基礎醫學院

3 吉林大學中日聯誼醫院

盧 佳(1979-)，女，主任醫師，主要從事角膜病及腫瘤分子生物學研究。

劉月英(1977-)，女，副主任醫師，主要從事重癥醫學研究。