X線輻射后A549細(xì)胞上清外泌體GPC1表達(dá)與細(xì)胞周期的關(guān)系

王立威 佟志敏 李 寧 李詩(shī)揚(yáng) 崔營(yíng)營(yíng) 陳玉丙

(長(zhǎng)春市人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130051)

X線輻射后A549細(xì)胞上清外泌體GPC1表達(dá)與細(xì)胞周期的關(guān)系

王立威 佟志敏1李 寧2李詩(shī)揚(yáng)2崔營(yíng)營(yíng)2陳玉丙2

(長(zhǎng)春市人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130051)

目的觀察X線輻射對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞周期及對(duì)細(xì)胞上清外泌體磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)1表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞A549并分別給予0、0.5、1、1.5、2 Gy劑量照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)6、12 h收集細(xì)胞，用PI法檢測(cè)細(xì)胞周期；收集細(xì)胞上清液，超速離心法提取外泌體，Western印跡檢測(cè)外泌體GPC1表達(dá)。結(jié)果G2期細(xì)胞的比例隨著劑量的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其他各劑量組與2 Gy組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各劑量組S期細(xì)胞比例均高于0 Gy組(P<0.05)；Western印跡結(jié)果顯示，隨輻射劑量增大，GPC1表達(dá)量逐漸降低。結(jié)論輻射能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞G2期、S期阻滯，同時(shí)細(xì)胞上清外泌體GPC1蛋白表達(dá)減少，二者具有相關(guān)性。

外泌體；肺癌；磷脂酰肌醇蛋白聚糖

目前肺癌主要以化療、放療、靶向治療等綜合治療為主，其中放射治療是治療局部晚期肺癌的有效方法，普遍應(yīng)用于臨床〔1〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不少蛋白在放射治療中起著增敏、指示預(yù)后等重要作用〔2〕。磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)1在胰腺癌、乳腺癌、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)，起著腫瘤生物標(biāo)志物的作用〔3〕。外泌體是在多泡體內(nèi)形成的小囊泡，通過(guò)胞吐釋放，在血液、尿液等多種體液中均能被檢測(cè)到，外泌體膜表面分布著多種蛋白，能夠揭示其來(lái)源細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)〔4，5〕。研究發(fā)現(xiàn)GPC1 可以準(zhǔn)確鑒別出健康人、良性胰腺疾病與早期胰腺癌、晚期胰腺癌〔6,7〕。目前A549細(xì)胞外泌體GPC1與放療的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道，本文利用不同劑量的X線照射肺腺癌A549細(xì)胞，觀察輻射對(duì)A549細(xì)胞周期及對(duì)A549細(xì)胞上清液中外泌體GPC1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 肺腺癌A549細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清(Biologicallndustries，以色列)；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒、免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；蛋白電泳試劑(生工生物工程(上海)股份有限公司)；蛋白預(yù)染mark、SDS-PAGE上樣緩沖液(Thermo，美國(guó))；Anti-GPC1抗體(Abcam，美國(guó))；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；瓦里安直線加速器23(EXVarianMedicalSystems,Inc.)；蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)；超速離心機(jī)(貝克曼，美國(guó))；酶標(biāo)儀、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光儀(Gene，美國(guó))

1.2肺腺癌細(xì)胞A549的培養(yǎng) 在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備9 ml無(wú)血清培養(yǎng)基置于離心管內(nèi)，將細(xì)胞從液氮內(nèi)取出置于37℃水浴中使其快速融化，吸入先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)液中1 200 r/min離心3 min，棄上清加入6 ml含10%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，換新鮮培養(yǎng)液，2 d傳代一次。

1.3A549細(xì)胞照射及細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并計(jì)數(shù)，按每孔2×105/ml細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板中，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。分別給予0、0.5、1、1.5、2 Gy劑量照射細(xì)胞，照射后在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12 h后收集細(xì)胞，每管加1 ml 75%酒精固定過(guò)夜；按下列比例配制細(xì)胞周期緩沖液：1 ml緩沖液、碘化丙啶PI 25 μl，RNase A 20 μl。每管分別加入500 μl上述緩沖液。于37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.4超離法提取細(xì)胞上清外泌體、Western印跡法檢測(cè)外泌體GPC1表達(dá) 將A549細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，以2×107/ml細(xì)胞數(shù)接種于T75培養(yǎng)瓶中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；按0、0.5、1、1.5、2 Gy劑量分別照射細(xì)胞，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6、12 h后收集細(xì)胞上清；利用超速離心法提取上清液中的外泌體：(1)將細(xì)胞上清液收集到50 ml離心管內(nèi)4℃、2 000 r/min離心30 min；(2)將上清轉(zhuǎn)移到干凈的超速離心管，4℃、12 000 r/min離心45 min；(3)將上清轉(zhuǎn)移到干凈的超速離心管，4℃、110 000 r/min離心2 h，倒掉上清；(4)用9 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀，用0.22 μm 濾器過(guò)濾到另一個(gè)干凈的超速離心管中；(5)4℃、110 000 r/min離心70 min，倒掉上清；(6)用500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP 管中；加300 μl蛋白裂解液，置于-70℃和37℃環(huán)境中各1 h反復(fù)凍融。應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)樣品蛋白進(jìn)行定量測(cè)定；配制15%的分離膠：準(zhǔn)備10 μg蛋白，沸水煮10 min，12 000 r/min離心10 min，調(diào)節(jié)電壓為80 V，進(jìn)行電泳。待樣品跑到分離膠處調(diào)節(jié)電壓為120 V；觀察溴酚藍(lán)遷移至玻璃板下沿時(shí)關(guān)閉電源結(jié)束電泳并準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜；300 mA轉(zhuǎn)膜90 min；按1∶1 000比例加入一抗(注意不要有氣泡)，于4℃封閉過(guò)夜；按1∶1 000比例加入二抗，放于37℃水平搖床孵育1 h；取ECL顯色液各1 ml混勻后加到膜上，確保膜的每個(gè)位置均接觸ECL，再于ECL化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)顯色。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法及非參數(shù)檢驗(yàn)法。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量X線輻射A549細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)6、12 h后細(xì)胞周期的變化 與0 Gy組相比，各劑量組細(xì)胞G2期的比例隨著輻射劑量的增加而增加(P<0.001)。各劑量組S期細(xì)胞比例均高于0 Gy組(P<0.05)。

2.2不同劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng)6、12 h后A549細(xì)胞上清液外泌體GPC1蛋白表達(dá)情況 培養(yǎng)6、12 h后，與0 Gy組相比各劑量組GPC1蛋白表達(dá)均減少(P<0.001)，以2 Gy組減少最為明顯(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 A549細(xì)胞上清液外泌體GPC1蛋白檢測(cè)電泳圖

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)，局部晚期非小細(xì)胞肺癌的治療主要是以放射治療為主的綜合治療〔8〕。通過(guò)輻射作用，腫瘤細(xì)胞周期、增殖均可受到抑制，從而阻止腫瘤細(xì)胞的惡性增長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明放療可以引起肺腺癌A549細(xì)胞G2期、S期阻滯，且G2期隨輻射劑量的增加阻滯作用越明顯。放療可以抑制A549細(xì)胞上清外泌體GPC1蛋白的表達(dá)且呈劑量依賴(lài)性。與以往研究結(jié)果一致〔8～10〕。外泌體是在細(xì)胞內(nèi)形成的小囊泡，通過(guò)胞吐作用釋放到細(xì)胞外，其內(nèi)容物包括蛋白、核酸、脂質(zhì)等多種物質(zhì)，起著信息傳遞、調(diào)控等作用〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，輻射可以通過(guò)影響外泌體中內(nèi)容物的表達(dá)，從而發(fā)揮特異的生物功能〔12〕。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體富含GPC1，Melo等〔7〕在胰腺癌血漿外泌體中檢測(cè)到GPC1高表達(dá)，可準(zhǔn)確將健康人與胰腺癌、良性胰腺疾病與早晚期胰腺癌加以鑒別，作為胰腺癌的生物標(biāo)志物。本研究提示其在非小細(xì)胞肺癌中具有診斷價(jià)值。本研究成功地在A549細(xì)胞上清中檢測(cè)到外泌體GPC1的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著輻射劑量增加，外泌體GPC1表達(dá)逐漸減少，這與輻射的周期抑制作用相一致。提示GPC1很可能起到一種放療療效的指示作用，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

1She J,Yang P,Hong Q,etal.Lung cancer in China:challenges and interventions〔J〕.Chest,2013;143(4):1117-26.

2周發(fā)為,楊年紅,游文忠.CD24蛋白表達(dá)在術(shù)后放療宮頸癌患者預(yù)后中的意義 〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2016;26(4):39-44.

3Su G,Meyer K,Nandini CD,etal.Glypican-1 is frequently overexpressed in human gliomas and enhances FGF-2 signaling in glioma cells 〔J〕.Am J Pathol,2006;168(6):2014-26.

4Guo L,Guo N.Exosomes:potent regulators of tumor malignancy and potential bio-tools in clinical application 〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2015;95(3):346-58.

5Yu S,Cao H,Shen B,etal.Tumor-derived exosomes in cancer progression and treatment failure 〔J〕.Oncotarget,2015;6(35):37151-68.

6Herreros-Villanueva M,Bujanda L.Glypican-1 in exosomes as biomarker for early detection of pancreatic cancer 〔J〕.Ann Transl Med,2016;4(4):64.

7Melo SA,Luecke LB,Kahlert C,etal.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer 〔J〕.Nature,2015;523(7559):177-82.

8宋淑軍,左曉勇,徐冰心,等.X線照射劑量率對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響 〔J〕.癌癥進(jìn)展,2016;14(10):970-6.

9羅利民.電離輻射對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響〔J〕.2009;15(5):410-1.

10楊艷明,王志成,王鐵君,等.乏氧 /輻射雙敏感啟動(dòng)子介導(dǎo)分泌型人 TRAIL基因?qū)Ψ蜗侔?A549細(xì)胞周期及增殖的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2009;29(6):1376-8.

11Fujita Y,Kosaka N,Araya J,etal.Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis〔J〕.Trends Mol Med,2015;21(9):533-42.

12王晨袁,邵春林.電離輻射誘導(dǎo)的外泌體的生物學(xué)效應(yīng)〔J〕.國(guó)際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志,2017;41(2)：121-4.

〔2017-07-13修回〕

(編輯 郭 菁)

R73

A

1005-9202(2017)18-4480-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.021

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20160101104JC)

1 吉林省申邦細(xì)胞工程研究所 2 吉林大學(xué)第二醫(yī)院

陳玉丙(1967-)，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤放射治療及基礎(chǔ)研究。

王立威(1964-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科疾病、立體定向放射治療研究。