Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

趙賢軍 康 暐 袁國(guó)強(qiáng) 周旺寧 潘亞文

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730030)

Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

趙賢軍 康 暐 袁國(guó)強(qiáng) 周旺寧 潘亞文

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730030)

目的探討Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響。方法抑制組用濃度為20 μmol/L的Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535處理腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞中不加入抑制劑。培養(yǎng)48 h后，噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷徙率，Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞遷移的數(shù)目，用Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、C-myc、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果抑制組細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)目、遷徙率和MMP-9、MMP-2蛋白水平與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01)。抑制組細(xì)胞中β-catenin、C-myc水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷徙及遷移能力。

腦膠質(zhì)瘤；增殖；遷移；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

腦膠質(zhì)瘤是一種顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率在全部惡性腫瘤發(fā)病率中占2%左右，治療后的生存期只有8～11個(gè)月〔1〕。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、血管瘤、腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種癌癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用〔2〕。有研究表明，20 μmol/L的Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路抑制劑FH535能夠抑制舌鱗癌、鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)癌細(xì)胞的遷移能力也具有一定的抑制作用〔3〕。本研究探究Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷徙和遷移能力的影響，以期為靶向抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路治療腦膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要儀器及試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone；β-catenin單克隆抗體、C-myc單克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9單克隆抗體、MMP-2單克隆抗體、β-actin單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CTS；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將保存于液氮中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251取出后放置37℃水浴鍋中溶解，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，加5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞兩次，用0.25%的胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 U251細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后消化，用細(xì)胞培養(yǎng)液把濃度調(diào)整到2×104個(gè)/ml，每孔加入100 μl細(xì)胞懸浮液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，在細(xì)胞中加入含有Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535濃度為20 μm的培養(yǎng)液，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在細(xì)胞中加入體積為10 μl，5 mg/ml的MTT，37℃下結(jié)合4 h。將上清液吸除后，加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)。為了提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以不加入細(xì)胞的孔為空白組用于調(diào)零。觀察結(jié)晶物完全融化后，放置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)每孔的光密度值(OD值)，計(jì)算每組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷徙能力 U251細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后種植到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)8h。在貼壁細(xì)胞中用槍頭小心的劃出一條細(xì)痕，用PBS把劃下的細(xì)胞洗掉。加入含有Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535濃度為20 μmol/L的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)痕的寬度。用細(xì)胞遷徙率表示細(xì)胞遷徙能力。遷徙率=(遷徙距離÷0 h劃痕距離)×100%。

1.6Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 U251細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。用含有Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535濃度為20 μmol/L的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，在Transwell小室的下室加入600 μl含有10% FBS的完全培養(yǎng)液，取每組細(xì)胞懸液各100 μl加入到上室。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸除小室上室的培養(yǎng)液，小心用棉簽擦掉附著在小室內(nèi)側(cè)的未穿膜的細(xì)胞。收集各組中下室的細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin、C-myc、MMP-9、MMP-2表達(dá)水平 取Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535濃度為20 μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后的U251細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白。用BCA定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液煮沸3 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(每個(gè)上樣孔中加入50 μl變性蛋白樣品)，80 V電壓下觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠邊緣時(shí)改用120 V電壓直至溴酚藍(lán)進(jìn)入到分離膠邊緣。4℃轉(zhuǎn)膜90 min。用5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗(600倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)反應(yīng)，顯色曝光，以β-actin作為內(nèi)參，分析計(jì)算目的蛋白的水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 抑制劑組細(xì)胞存活率〔(62.34±2.54)%〕明顯低于對(duì)照組〔(100.00±3.17)%〕(P<0.01)。

2.2細(xì)胞遷徙和遷移能力檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。抑制劑組細(xì)胞遷徙率、遷移細(xì)胞數(shù)目和MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。

2.3細(xì)胞中β-catenin、C-myc表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 抑制劑組中β-catenin、C-myc表達(dá)水平(0.28±0.03,0.57±0.06)明顯低于對(duì)照組(0.69±0.08,0.98±0.06)(P<0.01),提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。

表1 細(xì)胞遷徙率、遷移細(xì)胞數(shù)目及MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

3 討 論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育、組織器官形成過(guò)程中均具有重要作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠通過(guò)激活β-catenin，進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程〔4〕。在正常情況下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin與細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白以復(fù)合物的形式存在，當(dāng)受到某些條件刺激后，泛素蛋白酶依賴的蛋白降解途徑被激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin復(fù)合物被降解β-catenin表達(dá)升高〔5〕。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤有密切關(guān)系，在肝癌、鼻咽癌、舌鱗癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)有β-catenin的過(guò)度表達(dá)情況，當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑作用后的肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移能力均明顯降低〔6〕。FH535作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，能拮抗β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄〔7〕。本研究說(shuō)明20 μmol/L的FH535能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。另外FH535作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率明顯降低。提示抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。

腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的遷移有關(guān)。腫瘤細(xì)胞在受到特異性的遷移信號(hào)作用后，能夠產(chǎn)生移動(dòng)，而細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要組成部分〔8〕。細(xì)胞遷移過(guò)程受到MMP家族的作用，MMP-2、MMP-9能夠降解Ⅳ型膠原酶〔9〕。有研究表明，MMP-2、MMP-9在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔10〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)H535作用后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷徙能力、遷移能力均明顯降低，而細(xì)胞內(nèi)的MMP-2、MMP-9表達(dá)水平也明顯下降，提示FH535能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，作用機(jī)制與MMP-2、MMP-9有關(guān)。

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〔2017-06-07修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R739.41

A

1005-9202(2017)18-4474-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.018

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1606RJZA201)

趙賢軍(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事顱腦腫瘤、腦血管疾病研究。