c-Jun氨基末端激酶在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制

蔡金鳳 陳 燕 張 晨 柳 達

(石河子大學醫學院第一附屬醫院老干二科，新疆 石河子 832000)

c-Jun氨基末端激酶在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制

蔡金鳳 陳 燕 張 晨 柳 達

(石河子大學醫學院第一附屬醫院老干二科，新疆 石河子 832000)

目的探討 c-Jun氨基末端激酶(JNK)在大鼠腦缺血再灌注(CIR)損傷中的作用。方法構建CIR大鼠模型，同時在大鼠腦側室給予JNK抑制劑-SP600125抑制JNK的激活。采用5分制對造模后的大鼠行為學評分，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色分析大鼠CIR后腦梗死體積。原位末端標記(TUNEL)法檢測大鼠腦組織中神經細胞凋亡情況，Western印跡檢測大鼠腦組織中B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bax、裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(酶切-caspase)3、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、JNK蛋白表達水平。結果模型組CIR損傷后3、24、72 h行為學評分均明顯高于假手術組(P<0.01)，說明成功構建了大鼠CIR模型。實驗組CIR損傷后3、24、72 h行為學評分均明顯低于模型組(P<0.01)。腦梗死再灌注后3、24和72 h模型組大鼠腦組織中腦梗死體積、細胞凋亡率均明顯高于假手術組，實驗組均明顯低于模型組(均P<0.01)。模型組腦組織中Bax、酶切-caspase3蛋白表達水平均明顯高于假手術組，Bcl-2蛋白表達水平明顯低于假手術組(P<0.01)。實驗組中Bax、酶切-caspase3蛋白表達水平均明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于模型組(均P<0.01)。實驗組JNK的表達水平低于模型組(P<0.01)。模型組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α水平均明顯高于假手術組，實驗組均明顯低于模型組(均P<0.01)。結論抑制JNK激活可以減輕大鼠CIR損傷，作用機制可能與Bcl-2、Bax、酶切-caspase3表達有關。

腦缺血再灌注；c-Jun氨基末端激酶(JNK)；腦梗死體積；細胞凋亡

腦缺血再灌注(CIR)損傷是由于多種原因引起的腦部血流供應不足而形成〔1〕，腦缺血4.5 h后如果血液供應恢復，細胞會產生一系列的反應引起CIR損傷〔2〕。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白家族的成員之一，JNK的激活與細胞凋亡具有密切關系〔3〕，研究表明，在CIR損傷中JNK異常激活〔4〕。本研究構建大鼠CIR損傷模型，抑制模型中JNK的激活，探討JNK的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：4月齡SD雄性大鼠54只，購于新疆石河子大學醫學院，體重260～300 g。主要儀器及試劑：二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司；JNK抑制劑-SP600125購于上海高創化學科技有限公司；原位末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購于上海前塵生物科技有限公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、白細胞介素(IL)-1β單克隆抗體、裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(酶切-caspase)3單克隆抗體、腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體均購于美國CST；顯微鏡購于美國Thermo。

1.2CIR動物模型構建 實驗分為假手術組、模型組和實驗組，每組18只大鼠。每組每個時間點分為一個亞組，每個亞組6只大鼠。3組大鼠造模前12 h禁食，不限制飲水。大鼠均按照3.5 ml/kg的劑量用濃度為10%的水合氯醛麻醉，10 min后觀察大鼠完全麻醉并固定到鼠板上小心減掉大鼠頸部和前胸部毛。在大鼠正中線偏左位置縱向切開，用小腳彎鑷在切口處將皮下的筋膜、甲狀腺、肌肉剝離，把氣管周圍的組織剝離干凈，找到頸總動脈(CCA)。沿著氣管左側分離血管后在頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)分叉處分離迷走神經和血管，將手術線穿過CCA、ICA、ECA，在CCA的近心臟端進行結扎。在ICA和ECA分叉處用手術線結扎ECA，用微動脈夾將ICA夾閉。在CCA形成分叉大約4 cm處縱向刺一個孔，將拴線自CCA沿分叉處小心插入，插入深度大約為11 cm時扎緊ICA的手術線，縫合傷口后30 min將拴線拉退到CCA處，將大鼠在37℃的環境下平放2 h，待大鼠蘇醒后把拴線抽出來，用Willis環對大鼠實現動脈缺血后再灌注。假手術組只暴露大腦中動脈后不插入拴線，其他步驟同模型組和實驗組。假手術組和模型組在CCA夾閉前30 min在腦側室分別給予10 ml/L的二甲基砜(DMSO)溶液10 μl，實驗組給予含有JNK抑制劑-SP600125的DMSO溶液10 μl。

1.3行為學評分 大鼠行為學評分按照5分制評分標準：大鼠術后可以自由活動，沒有表現出任何異常癥狀計0分；大鼠術后前爪不能自由伸展計1分；大鼠術后出現不自主的轉圈計2分；大鼠不能正常直立，不自主傾倒計3分；大鼠喪失意識計4分。

1.42，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色檢測腦梗死體積 將大鼠斷頭處死，在冰上分離出腦組織。放置于-20℃冰箱30 min后切片，厚度約2 mm。將腦組織切片放置于1%的TTC溶液中，置于37℃孵育染色50 min，4%多聚甲醛緩沖液固定。正常組織會被染成粉紅色，腦缺血組織中不被著色，呈現白色即為腦梗死區域，用圖像分析軟件計算每組大鼠腦組織的腦梗死體積。

1.5腦組織神經細胞凋亡情況檢測 將腦組織切片放置于二甲苯中浸泡20 min，依次在95%、90%、80%、70%的濃度梯度酒精中浸泡5 min。用組化筆在切片組織周圍畫個圈，在圈內滴加蛋白酶K溶液，放置于室溫下孵育反應15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min。甩干后在圈內滴加破膜工作液，放在室溫下靜置10 min，PBS洗滌后滴加TUNEL染液，放在濕盒內，37℃反應50 min后，PBS洗滌后甩干，在切片上加4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，置于避光條件下室溫孵育反應10 min。PBS洗滌3次后封片。在倒置顯微鏡下選擇相同的5個視野，分析細胞凋亡情況。

1.6Western印跡檢測Bcl-2、Bax、酶切-caspase3、IL-1β、TNF-α表達水平 取大鼠CIR 24 h的大鼠腦組織，剪碎后轉移到勻漿器中，在組織中加入冰預冷的含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液，取2 ml裂解液加入勻漿器中，置于冰上研磨。轉移組織研磨液至離心管中，14 000 r/min，4℃離心10 min。吸取蛋白上清液至新的EP管中，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。取適量的蛋白與上樣緩沖液充分混合后，100℃煮沸5 min，取變性蛋白加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣孔中，每孔加入變性蛋白樣品50 μl。80 V電壓電泳30 min后調整為120 V電壓直到電泳結束，取出蛋白凝膠按照常規方法4℃轉膜2 h。取出轉印后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入5%脫脂奶粉封閉液中封閉后，依次與一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)孵育后PBS洗滌，滴加顯色液，在暗室中曝光，分析蛋白表達水平。

1.7統計學處理 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1大鼠行為學評分 模型組CIR損傷后3、24、72 h行為學評分均明顯高于假手術組(P<0.01)，說明成功構型。實驗組均明顯低于模型組(P<0.01)。且CIR損傷后24 h大鼠行為學評分最高。見表1。

2.23組腦組織中腦梗死體積及細胞凋亡率比較 模型組腦梗死再灌注后3、24和72 h大鼠腦組織中腦梗死體積、細胞凋亡率均明顯高于假手術組，實驗組均明顯低于模型組(均P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠CIR后行為學評分、腦梗死體積、細胞凋亡率比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

2.3大鼠CIR后24 h腦組織中Bcl-2、Bax和酶切-caspase3蛋白表達水平比較 模型組腦組織中Bax、酶切-caspase3蛋白表達水平均明顯高于假手術組，Bcl-2蛋白表達水平明顯低于假手術組。實驗組Bax和酶切-caspase3蛋白表達水平均明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于模型組(P<0.01)。見表2，圖1。

圖1 大鼠腦組織中Bcl-2、Bax、酶切-caspase3 蛋白表達結果

組別Bcl-2Bax酶切-caspase3假手術組1.12±0.130.15±0.090.13±0.02模型組0.21±0.101)0.85±0.241)0.56±0.161)實驗組0.46±0.122)0.40±0.122)0.24±0.032)

2.4Western印跡檢測細胞中IL-1β、TNF-α、JNK表達水平 模型組IL-1β、TNF-α水平均明顯高于假手術組(P<0.01)，實驗組均明顯低于模型組(均P<0.01)。實驗組JNK表達水平低于模型組(P<0.01)。見圖2，表3。

圖2 大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達

組別TNF-αIL-1βJNK假手術組0.13±0.040.12±0.0376.57±0.06模型組0.87±0.061)1.03±0.131)78.98±0.07實驗組0.51±0.072)0.41±0.082)0.09±0.022)

3 討 論

近年來，對CIR損傷的發病機制研究主要集中在自由基、鈣超載、生物膜損傷、白細胞作用等方面〔5〕。JNK作為一種可以調控細胞增殖、凋亡、應激等生物學特性的蛋白激酶，在腦缺血損傷組織中過度激活〔6～8〕。本研究結果說明抑制JNK的激活可以減弱大鼠CIR損傷，降低大鼠腦組織中腦梗死的體積。CIR發生過程中腦組織神經元細胞凋亡是造成損傷的重要途徑〔9〕，在細胞凋亡過程中，Bcl-2蛋白家族發揮重要作用〔10〕，根據作用不同，可以將凋亡相關蛋白分為促凋亡蛋白和抑制細胞凋亡蛋白〔11〕。Bcl-2在細胞凋亡過程中發揮抑制作用，而Bax發揮促進作用〔12，13〕，Cleaved-caspase3在Caspase級聯反應中發揮凋亡執行的作用。本研究結果提示抑制JNK的激活可以有效抑制腦組織中的細胞凋亡。

炎性反應廣泛存在于CIR損傷中，CIR損傷發生后大量中性粒細胞迅速聚集到損傷部位，而中性粒細胞的聚集會引起微循環的阻塞，對腦組織血液流通的恢復發揮阻礙作用〔14，15〕，當中性粒細胞聚集到腦組織缺血區域時，釋放的蛋白分解酶和氧自由基具有加重CIR損傷的作用〔16〕。本研究結果提示抑制JNK可以減輕大鼠CIR損傷的炎癥反應。

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3Han MS，Barrett T，Brehm MA，etal.Inflammation mediated by JNK in myeloid cells promotes the development of hepatitis and hepatocellular carcinoma〔J〕.Cell Rep，2016；15(1)：19-26.

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〔2016-09-20修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R743

A

1005-9202(2017)18-4472-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.017

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目(2012213A063)

蔡金鳳(1984-)，女，碩士，主治醫師，主要從事老年高血壓、冠心病研究。