中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對顱腦損傷大鼠腦組織的保護(hù)作用

熊啟江 蘇 海 張 毅 蘇祖祿 陳 皓

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 402160)

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對顱腦損傷大鼠腦組織的保護(hù)作用

熊啟江 蘇 海 張 毅 蘇祖祿 陳 皓

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 402160)

目的探討中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)抑制劑西維來司鈉對顱腦損傷(TBI)大鼠腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制。方法SD大鼠70只，隨機(jī)分為對照組(n=10)、TBI組(n=30)和干預(yù)組(n=30)，TBI組和干預(yù)組又分為24、72、168 h亞組。用液壓打擊方法制備TBI模型，TBI組術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水，干預(yù)組術(shù)后立即腹腔注射西維來司鈉。于術(shù)后24、 72和168 h取挫傷側(cè)腦組織標(biāo)本，測定NE、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和髓過氧化物酶(MPO)活性和含量。結(jié)果與對照組相比，TBI組腦組織NE、MDA含量和MPO活性明顯增高(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)；與TBI組相比，干預(yù)組腦組織NE、MDA含量和MPO活性明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯增高(P<0.05)。結(jié)論西維來司鈉可以通過抑制NE活性，抑制中性粒細(xì)胞活化和浸潤，減少自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)和功能的完整，對TBI大鼠腦組織具有保護(hù)作用。

顱腦創(chuàng)傷；中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶；西維來司鈉；髓過氧化物酶；超氧化物歧化酶；丙二醛

在顱腦損傷(TBI)復(fù)雜的病理生理過程中，活化的中性粒細(xì)胞(PMN)釋放的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮了重要作用，增加血腦屏障(BBB)通透性和加重腦水腫〔1，2〕。西維來司鈉作為NE的特異性抑制劑，被發(fā)現(xiàn)能夠降低TBI大鼠腦組織的NE含量，改善BBB通透性和減輕腦組織水腫，但機(jī)制尚不明確〔3〕。本研究通過TBI大鼠腹腔注射 NE 抑制劑西維來司鈉，觀察大鼠腦組織炎性介質(zhì)的變化，探討其對TBI繼發(fā)性損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物及分組 由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供體重200～250 g雄性健康SD大鼠70只〔動物許可證號：SYXK(渝)2012-0001〕，隨機(jī)分成三組：對照組(n=10)、TBI組(n=30)、干預(yù)組(n=30)，TBI組和干預(yù)組又按24、72、168 h時間點(diǎn)分為 3個亞組，每亞組10只SD大鼠。所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，造模后按亞組分籠飼養(yǎng)。

1.2TBI模型制作 采用Thompson方式制作TBI模型，10%水合氯醛以3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，用立體定位儀固定頭部，作頭皮正中切口，剝離骨膜，前囟人字縫尖連線中點(diǎn)偏右4 mm顱骨鉆孔，暴露完整硬腦膜。打擊管內(nèi)注滿水，與液壓腦創(chuàng)傷打擊裝置連接，制作TBI模型。對照組僅作頭皮切開，顱骨開窗，不作液壓打擊，干預(yù)組液壓打擊后立即給予腹腔注射西維來司鈉溶液(50 mg/kg)，傷后每24 h腹腔注射相同體積的西維來司鈉溶液，TBI組僅給予同體積的生理鹽水。

1.3腦組織NE含量測定 對照組、TBI組、干預(yù)組SD大鼠分別于相應(yīng)時間點(diǎn)，經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速斷頭取腦，取腦組織精確稱重，將腦組織用生理鹽水在冰浴環(huán)境內(nèi)以玻璃勻漿器制成10% 的腦組織勻漿，再采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法(ELISA)測定。

1.4髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量測定 按預(yù)定時間點(diǎn)將大鼠斷頭處死，以挫傷腦組織為中心去腦組織0.5 g，預(yù)冷的生理鹽水10 倍稀釋后，冰浴下充分勻漿，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液待用。采用ELISA試劑盒定量測定MPO活性，黃嘌呤氧化法測定SOD活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1西維來司鈉對NE含量的影響 與對照組比，TBI組、干預(yù)組NE含量明顯增多(P<0.05)；與TBI組比，干預(yù)組NE含量明顯降低(P<0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠腦組織NE含量比較

與對照組比較：1)P<0.05；與TBI組比較：2)P<0.05，下表同

2.2西維來司鈉對MPO活性的影響 與對照組比，TBI組、干預(yù)組MPO活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與TBI組比，干預(yù)組MPO活性明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.3西維來司鈉對 SOD活性的影響 與對照組比，TBI組、干預(yù)組SOD活性明顯下降(P<0.05)，與TBI組比，干預(yù)組SOD活性明顯增高(P<0.05)，見表3。

2.4西維來司鈉對MDA含量的影響 與對照組比，TBI組、干預(yù)組MDA含量明顯增多(P<0.05)；與TBI組比，干預(yù)組MDA含量明顯降低(P<0.05)，表明可以抑制MDA的產(chǎn)生，見表4。

表2 各組大鼠腦組織MPO活性比較

表3 各組大鼠腦組織SOD活性比較

表4 各組大鼠腦組織MDA含量比較

3 討 論

NE作為活化的PMN過量釋放的一種炎性因子，在TBI的繼發(fā)性腦損傷過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，NE除了能夠降解彈性蛋白外，還能降解層黏連蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，破壞細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而增強(qiáng)BBB通透性，加重腦組織水腫〔4〕。MDA和SOD作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠直接反映脂質(zhì)過氧化程度和機(jī)體清除氧自由基的能力，間接反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。MPO也是PMN活化的標(biāo)志物之一，其MPO活性程度反映PMN活化的重要指標(biāo)，MPO的增加被認(rèn)為與大腦皮質(zhì)及紋狀體的損傷程度呈正相關(guān)〔5〕。本研究說明腦組織損傷后，PMN被大量活化，釋放大量的炎性介質(zhì)，局部組織氧化和抗氧化平衡紊亂，大量自由基產(chǎn)生，清除自由基系統(tǒng)受到破壞或抑制，NE通過增強(qiáng)自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加重了細(xì)胞膜的損傷。這與Semple等〔6〕的研究結(jié)果一致，且發(fā)現(xiàn)NE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素之一，延緩和阻礙了神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)。

西維來司鈉是NE的特異性抑制劑，具有很高的專一性，能夠有效地減少NE的產(chǎn)生和抑制NE的功能〔7〕。最早用于治療急性肺損傷(ALI)，特別是全身性癥反應(yīng)綜合征并發(fā)的ALI，及由ALI導(dǎo)致的呼吸窘迫綜合征〔8〕。隨著對NE及抑制劑作用研究的不斷深入，其運(yùn)用范圍和前景被不斷擴(kuò)大。由于西維來司鈉分子量小，對氧化劑不敏感，能有效地通過BBB滲透到組織和細(xì)胞內(nèi)與NE活性中心結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而使NE失去作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用。本研究說明西維來司鈉通過減少NE的產(chǎn)生和抑制NE的活性，進(jìn)而減少PMN的活化和浸潤，降低在局部挫傷腦組織內(nèi)MDA的含量，提高SOD活性水平，增加自由基的清除和對抗自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，提高細(xì)胞生存狀態(tài)。目前對于NE和NE抑制劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究主要集中在缺血再灌注損傷和脊髓損傷領(lǐng)域。Stowe等〔4〕研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NE可以破壞BBB的完整性。NE特異性抑制劑在腦缺血再灌注的損傷模型中能夠通過抑制腦內(nèi)NE 活性，抑制自由基的過度產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化，下調(diào)TNF-α，從而切斷由缺血再灌注引起的組織損傷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)環(huán)，達(dá)到腦保護(hù)作用〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，NE特異性抑制劑能夠有效地減少脊髓損傷后的神經(jīng)功能損害〔10〕。

1Chodobski A，Zink BJ，Szmydynger-Chodobska J.Blood-brain barrier pathophysiology in traumatic brain injury〔J〕.Transl Stroke Res，2011；2(4)：492-516.

2Ikegame Y，Yamashita K，Hayashi S，etal.Neutrophil elastase inhibitor prevents ischemic brain damage via reduction of vasogenic edema〔J〕.Hypertens Res，2010；33(7)：703-7.

3蘇 海，蘇祖祿，賀學(xué)農(nóng)，等.中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對顱腦創(chuàng)傷大鼠血腦屏障通透性和腦水腫的影響〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2014；43(26)：3458-60.

4Stowe AM，Adair-Kirk TL，Gonzales ER，etal.Neutrophil elastase and neurovascular injury following focal stroke and reperfusion〔J〕.Neurobiol Dis，2009；35(1)：82-90.

5Weston RM，Jones NM，Jarrott B，etal.Inflammatory cell infiltration after endothelin-1-induced cerebral ischemia：histochemical and myeloperoxidase correlation with temporal changes in brain injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2007；27(1)：100-14.

6Semple BD，Trivedi A，Gimlin K，etal.Neutrophil elastase mediates acute pathogenesis and is a determinant of long-term behavioral recovery after traumatic injury to the immature brain〔J〕.Neurobiol Dis，2015；74：263-80.

7Wakayama F，F(xiàn)ukuda I，Suzuki Y，etal.Neutrophil elastase inhibitor sivelestat，attenuates acute lung injury after cardiopulmonary bypass in the rabbit endotoxemia model〔J〕.Ann Thorac Surg，2007；83：153-60.

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9胡 月，董 志，晏 飛.西維來司鈉對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009；29(6)：1459-62.

10Tonai T，Shiba K，Taketani Y，etal.A neutrophil elastase inhibitor (ONO-5046) reduces neurologic damage after spinal cord injury in rats〔J〕.J Neurochem，2001；78(5)：1064-72.

〔2016-08-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R64

A

1005-9202(2017)18-4465-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.014

重慶市衛(wèi)生局面上項目(No.2012-2-157)；重慶市永川區(qū)科委自然科學(xué)基金(No.Ycstc 2013 nc 8029)

蘇 海(1978-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)外科顱腦損傷，脊柱脊髓疾病研究。

熊啟江(1984-)，男，住院醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)外科顱腦損傷研究。