刺五加腦靈膠囊對(duì)氯化鋁致癡呆模型小鼠的保護(hù)作用

賈世亮 劉 婷 戴雪伶 高兆蘭 鄭秋生 孫雅煊

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系，北京 100191)

刺五加腦靈膠囊對(duì)氯化鋁致癡呆模型小鼠的保護(hù)作用

賈世亮 劉 婷1戴雪伶 高兆蘭 鄭秋生1孫雅煊

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系，北京 100191)

目的探討刺五加腦靈膠囊對(duì)氯化鋁致癡呆小鼠的保護(hù)作用。方法將60只SPF級(jí)昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、刺五加腦靈膠囊高、中、低劑量(1.01、0.33、0.10 g/kg)組。采用腹腔注射三氯化鋁建立阿爾茨海默病(AD)小鼠模型。觀察刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、乙酰膽堿酯酶(AchE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的影響。結(jié)果刺五加腦靈膠囊高劑量組自主活動(dòng)次數(shù)顯著多于模型組；刺五加腦靈膠囊組上岸時(shí)間顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少；刺五加腦靈膠囊中、高劑量組小鼠腦組織Aβ含量顯著降低，AchE活性顯著降低，ChAT活性顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論刺五加腦靈膠囊能減少Aβ沉積，增強(qiáng)ChAT活性同時(shí)降低AchE活性，對(duì)氯化鋁致癡呆小鼠有一定的改善和保護(hù)作用。

刺五加腦靈膠囊；阿爾茨海默?。沪?淀粉樣蛋白；乙酰膽堿酯酶；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶

阿爾茨海默病(AD)主要臨床特征是患者出現(xiàn)智力、記憶力、感覺定向的不可逆退化〔1〕。2010年世界AD患者大約有3 560萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2050年，世界AD患者的數(shù)量將達(dá)到1億1千萬(wàn)，其中中國(guó)AD患者將接近2 000萬(wàn)〔2,3〕。中醫(yī)在養(yǎng)生保健、益智健腦方面有著豐富的理論、實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，為篩選中藥有效成分防治癡呆提供了基礎(chǔ)〔4〕。中藥刺五加為五加科植物，味辛、微苦、性溫、無(wú)毒，具有多種藥理作用和臨床應(yīng)用，能益氣健脾、補(bǔ)腎安神〔5〕。而五味子中的主要成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有改善學(xué)習(xí)、記憶，鎮(zhèn)靜，催眠，抗衰老的作用〔6〕。刺五加腦靈膠囊由刺五加浸膏和五味子流浸膏組成，用于心脾兩虛、腎不足所致的健忘、心神不寧、失眠多夢(mèng)等。本研究觀察刺五加腦靈膠囊對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶、乙酰膽堿酯酶(AchE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)昆明種小鼠，60只，雌雄各半，17～19 g(中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)提供)。XZ-4小鼠自主活動(dòng)自動(dòng)控制記錄儀、LW-I小鼠水迷宮測(cè)試儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。刺五加腦靈膠囊(山東仙河藥業(yè)有限公司)；三氯化鋁(北京市李遂化工廠)；Aβ、ChAT、AchE檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2分組及給藥 將60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、刺五加腦靈膠囊高、中、低劑量(1.01、0.33、0.10 g/kg)組。刺五加腦靈膠囊組灌胃給予相應(yīng)藥物，模型組和正常對(duì)照組灌胃給予同體積生理鹽水，連續(xù)58 d。

1.3建立AD小鼠模型 所有造模動(dòng)物從給藥后第5天開始隔日1次腹腔注射三氯化鋁100 mg/kg(0.1 ml/10 g)造模，正常對(duì)照組腹腔注射同體積生理鹽水，連續(xù)50 d。

1.4行為學(xué)測(cè)試 造模第51天，小鼠灌胃給藥后1 h，放入XZ-4小鼠自主活動(dòng)計(jì)數(shù)儀中，穩(wěn)定5 min后，記錄小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)數(shù)。造模第53天，于暗室中將LW-I水迷宮自動(dòng)控制記錄儀通電，放水，水溫20℃～21℃，室溫20℃。小鼠灌胃給藥后1 h，放入水迷宮中訓(xùn)練A點(diǎn)1次，最長(zhǎng)上岸時(shí)間以2 min為止。2 h后再訓(xùn)練A點(diǎn)1次，記錄上岸時(shí)間和回頭錯(cuò)誤次數(shù)；再4 h后放入B點(diǎn)，記錄小鼠上岸時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)，上岸時(shí)間最長(zhǎng)以2 min計(jì)。造模第54天，將已訓(xùn)練小鼠放入水迷宮B點(diǎn)，測(cè)定上岸時(shí)間和回頭錯(cuò)誤次數(shù)，上岸時(shí)間最長(zhǎng)以2 min計(jì)。

1.5指標(biāo)檢測(cè) 58 d灌胃給藥結(jié)束后，斷頭處死大鼠，迅速取出腦組織，置于冰盒上，分離海馬并稱重。按照1∶10(W∶V)的比例加入冰生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腦組織中Aβ含量、ChAT、AchE兩種酶的活性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠自主活動(dòng)的影響 表1可見，模型組小鼠自主活動(dòng)數(shù)量顯著少于正常對(duì)照組(P<0.01)，刺五加腦靈膠囊高劑量組自主活動(dòng)次數(shù)顯著多于模型組(P<0.05)。各組小鼠體重差異不明顯(P>0.05)。

表1 各組自主活動(dòng)、體重比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

2.2刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 造模后，模型組與正常對(duì)照組比較水迷宮試驗(yàn)各點(diǎn)訓(xùn)練和測(cè)試的上岸時(shí)間均延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)均增多(均P<0.01)。刺五加腦靈膠囊高劑量組第2天測(cè)試的B點(diǎn)上岸時(shí)間顯著縮短，低、中、高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)都顯著減少(P<0.05,P<0.01)。見表2。

2.3刺五加腦靈膠囊對(duì)AD小鼠海馬組織Aβ、ChAT、AchE的影響 模型組小鼠海馬組織Aβ含量顯著高于正常對(duì)照組(均P<0.01)，ChAT活性顯著低于正常對(duì)照組，AchE活性顯著高于正常對(duì)照組。與模型組比較，刺五加腦靈膠囊中、高劑量組小鼠海馬組織Aβ含量顯著降低，ChAT活性顯著增加，AchE活性顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組學(xué)習(xí)記憶、海馬組織Aβ、ChAT、AchE的影響

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

鋁可導(dǎo)致腦組織神經(jīng)元纖維纏結(jié)和老年斑的形成〔7〕。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，飲用水含鋁量高的地區(qū)，AD的發(fā)病率較高，為其他地區(qū)的1.5～2.7倍〔8〕。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，鋁在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積可明顯抑制學(xué)習(xí)記憶功能，使動(dòng)物出現(xiàn)AD的特征性病理改變〔9〕。本研究顯示刺五加腦靈膠囊有較好的改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。AD是多病因相互作用的結(jié)果，其中，老年斑主要是由具有神經(jīng)毒性和血管毒性的Aβ生成，同時(shí)，Aβ沉積又可導(dǎo)致突觸和神經(jīng)棘缺失，嚴(yán)重影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能，最終造成大腦學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力損傷〔10〕。在正常生理狀態(tài)下，大腦僅表達(dá)少量的Aβ，低濃度的Aβ可營(yíng)養(yǎng)未分化、不成熟的神經(jīng)元；而在AD大腦中Aβ則大量表達(dá)，高濃度的Aβ能損傷已分化、成熟的神經(jīng)元〔11〕。Aβ沉積可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其釋放促炎因子和一氧化氮，從而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔12〕；聚集的Aβ可引起神經(jīng)元反應(yīng)性活性氧增高，造成神經(jīng)元氧化損傷；可破壞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡〔13〕；還可改變線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔14〕。AchE的作用是分解乙酰膽堿，與 ChAT 共同調(diào)節(jié)乙酰膽堿的動(dòng)態(tài)平衡〔15〕。同時(shí)，AchE作為乙酰膽堿的水解酶，其變化一般晚于ChAT，因此在AD發(fā)病初期，由于ChAT異常所致合成減少的乙酰膽堿，仍被正常的AchE分解，致使突觸間乙酰膽堿含量的減少〔16〕。Aβ沉積會(huì)增加AchE表達(dá)，在AD患者大腦老年斑和膽堿能神經(jīng)元丟失區(qū)域內(nèi)AchE活性顯著升高，造成乙酰膽堿異常。AchE又能促進(jìn)Aβ生成，加速其聚積〔17〕，進(jìn)而形成一種惡性循環(huán)。

綜上所述，在 AD 的發(fā)病機(jī)制中膽堿能神經(jīng)異常及Aβ毒性在其發(fā)病中占有重要作用。到目前為止，美國(guó)FDA認(rèn)可上市的治療AD的藥物主要是AchE抑制劑，即通過(guò)降低AchE的活性提高大腦中AchE的含量，進(jìn)而改善神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的學(xué)習(xí)和記憶功能的下降〔18〕。因此，探尋毒副作用小而功效作用強(qiáng)的AchE抑制劑，是研究防治AD藥物的有效途徑之一。本研究提示刺五加腦靈膠囊能夠通過(guò)減少Aβ沉積，增加ChAT活性，降低AchE活性，改善小鼠海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，達(dá)到防治AD的作用。但是，由于刺五加腦靈膠囊成分復(fù)雜，其確切地改善學(xué)習(xí)記憶能力的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，且其調(diào)節(jié)AD的具體分子機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。

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〔2016-06-14修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

R285.5

A

1005-9202(2017)18-4463-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.013

北京市教委面上項(xiàng)目(SQKM201411417014)；北京聯(lián)合大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(ZK70201402)

1 石河子大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系

孫雅煊(1970-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物活性物質(zhì)的提取及生理功能研究。

賈世亮(1990-)，男，碩士，主要從事生物活性物質(zhì)的生理功能研究。