攜帶凋亡素VP3基因重組腺病毒的制備及其在人結腸癌SW480細胞中的表達

鄧守恒 胡 茵 曹風軍 蔡曉軍 李林均 陳 萍

(湖北醫藥學院附屬人民醫院腫瘤中心，湖北 十堰 442000)

攜帶凋亡素VP3基因重組腺病毒的制備及其在人結腸癌SW480細胞中的表達

鄧守恒 胡 茵 曹風軍 蔡曉軍 李林均 陳 萍

(湖北醫藥學院附屬人民醫院腫瘤中心，湖北 十堰 442000)

目的利用細菌內同源重組法構建攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒并觀察其在人結腸癌SW480細胞中的表達。方法擴增目的基因VP3 cDNA，與EcoR Ⅴ酶切線性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭質粒連接構建重組穿梭質粒pShuttle-VP3-hrGFP，PmeⅠ酶切線性化pShuttle-VP3-hrGFP并轉化含pAdeasy-1的超感受態BJ5183大腸桿菌，細菌內同源重組法構建重組腺病毒質粒pAd-VP3-hrGFP，并經PCR、EcoR Ⅴ、PacⅠ酶切電泳及測序鑒定，線性化的重組腺病毒質粒經脂質體包裹轉染AD293細胞進行重組腺病毒的包裝和擴增，CsCI密度梯度離心法行病毒濃縮和純化并將其感染人結腸癌SW480細胞中進行表達，觀察其感染效率及VP3蛋白表達水平。結果pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質粒構建鑒定成功，PCR反應擴增出402 bp的片段；pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒經酶切獲得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段，重組腺病毒質粒經測序證實VP3-hrGFP編碼區成功克隆入腺病毒pAd中，且其序列與GenBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包裝出攜帶VP3基因的重組腺病毒，滴度為1.738×1012opu/ml，重組腺病毒可在SW480細胞內得到有效表達。結論用細菌內同源重組法可快速、高效地制備攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒，并可在人結腸癌細胞中高效表達。

同源重組；凋亡素；腺病毒；人結腸癌細胞

凋亡素VP3基因來源于雞貧血病毒，其編碼的VP3蛋白僅可誘導腫瘤細胞或轉化細胞凋亡，而對正常細胞和二倍體細胞不起作用，被認為是第一個真正意義上具有選擇性殺傷腫瘤的凋亡蛋白〔1，2〕。研究顯示VP3蛋白發揮抗腫瘤作用與其在細胞中的定位密切相關，VP3蛋白定位于腫瘤細胞核內，通過磷酸化反應與DNA結合誘導腫瘤細胞凋亡，而在正常細胞中，VP3蛋白則定位于細胞質中不能發生磷酸化反應，基于生物膜的屏障作用，通過增加VP3蛋白的跨膜能力以增強其選擇性殺傷腫瘤細胞能力成為當前的研究熱點〔3，4〕。本組前期利用Pep-1穿膜肽構建的Pep-1-VP3融合蛋白理論上能夠增強VP3蛋白的跨膜能力，然而，由于工程菌表達量低，表達產物有包涵體以及分離和純化蛋白技術受限等使得制備的融合蛋白在后續研究中效果并不令人滿意〔5，6〕。為解決以上難題，筆者又選用改良腺病毒作為載體，采用細菌內同源重組法構建攜帶VP3基因的重組腺病毒并作用于體外培養的人結腸癌細胞株SW480，觀察其透膜及表達情況。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 SW480及AD293細胞、PET15b-VP3重組質粒、腺病毒穿梭質粒pShuttle-IRES-hrGFP、感受態大腸桿菌DH5α和超感受態大腸桿菌BJ5183、pfuDNA聚合酶，EcoR Ⅴ、PmeⅠ、PacⅠ、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)均由湖北醫藥學院臨床醫學研究所提供；超速冷凍離心機(HCP80MX，日本)、PCR儀(Biometra，德國)、凝膠圖像分析系統(Touching 995gel document system，上海)。

1.3pShuttle-VP3-GFP重組穿梭質粒的構建及鑒定 采用定向同源重組法連接經EcoR Ⅴ酶切線性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭質粒和含VP3基因 PCR擴增產物，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α后行PCR鑒定，鑒定體系為：50×dNTP(10 mmol/L)1 μl，10倍緩沖液5 μl，10×上游引物P1 5 μl，10×下游引物P25 μl，含重組質粒的菌落1 μl、pfuDNA聚合酶1 μl加去離子水至50 μl，鑒定正確后大量培養細菌，抽提質粒行EcoR Ⅴ酶切電泳鑒定。

1.4pAd-VP3-GFP重組腺病毒質粒的構建及鑒定 PmeI酶切上述鑒定正確的pShuttle-VP3-GFP重組穿梭質粒24 h后，3 mol/L NaAc和無水乙醇沉淀DNA，漂洗離心棄上清，加入3 μl CIAP 37℃恒溫水浴1 h后在50℃烤箱里去磷酸化2 h，經酚、氯仿抽提后轉化含腺病毒骨架質粒pAdeasy-1的BJ5183，通過TB固體培養基鋪板對含有重組質粒的BJ5183進行初篩(因含有重組質粒的細菌可在含卡那霉素的培養基中生長形成克隆菌落)，挑取單克隆菌落，小量培養并提取質粒，PacI酶切電泳，若出現大于23 kb和45 kb或30 kb的特征性條帶，即為陽性質粒，大量擴增并抽提陽性質粒，送上海生工公司測序。

1.5pAd-VP3-GFP重組腺病毒制備 脂質體包裹PacⅠ酶切線性化的pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒并轉染AD293細胞，取第一代病毒上清再轉染293細胞，依上述方法再取第二代上清重復轉染293細胞，收集并裂解細胞獲得上清液，氯化銫密度梯度離心純化病毒，紫外光度計檢測病毒OD260和OD280值，病毒滴度=OD260×病毒稀釋倍數×1.1×1012。

1.6pAd-VP3-GFP重組腺病毒在SW480細胞中的表達 體外復蘇并培養SW480細胞，長至75%～80%融合時，分別取MOI=0、100、200、300的病毒進行感染，倒置熒光顯微鏡下觀察不同時間點細胞中GFP的表達情況，收集感染60 h的SW480細胞，提取總蛋白進行VP3蛋白的Western印跡檢測。

2 結 果

2.1VP3基因擴增及pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質粒的構建及鑒定 以PET15b-VP3為模板行PCR擴增后電泳可見特征性402 bp VP3基因片段，回收擴增產物與線性化的穿梭質粒pShuttle-IRES-hrGFP混合，將混合后的產物轉化DH5α，取轉化菌液在TB瓊脂糖上鋪板，次日取單克隆菌落PCR擴增后電泳也可見特征性的402 bp條帶。大量培養陽性克隆菌落，抽提質粒經EcoR Ⅴ酶切后電泳后可見8.9 kb和402 bp兩條帶，說明VP3基因已成功插入到穿梭質粒pShuttle-IRES-hrGFP中，pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質粒構建成功。見圖1。

2.2pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒構建及鑒定 將酶切線性化的pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質粒轉化超感受態大腸桿菌BJ5183并鋪板，次日挑取轉化菌落提取DNA，PacI酶切電泳可見大于23 kb和45 kb的片段，見圖2，說明pAdeasy-1與pShuttle-VP3-hrGFP在復制起始位點與右臂之間發生了同源重組。pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒測序結果顯示其VP3基因序列與GenBank的VP3 cDNA序列完全一致，見圖3，說明VP3基因已成功插入到骨架質粒pAdeasy-1中，pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒構建成功。

M：DNA Marker；1：pShuttle-VP3-hrGFP經EcoR Ⅴ酶切后 (8.9 kb、402 bp)圖1 pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質粒酶切鑒定結果

M：DNA Marker；1：pAd-VP3-hrGFP經PacI酶切后(>23 kb、4.5 kb)圖2 pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒酶切鑒定結果

圖3 pAd-VP3-GFP重組腺病毒質粒部分測序結果

2.3pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒包裝及滴度測定 酶切線性化pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒質粒，脂質體包裹后轉染AD293細胞，培養1 w后可見綠色熒光蛋白(GFP)表達，見圖4A，此后細胞出現病變效應，見圖4B。待病變效應達到80%至90%時，收集細胞，反復凍融后離心獲得病毒上清液，純化病毒，檢測OD260和OD280值分別為0.158和0.119，OD260/OD280=0.158/0.119=1.33>1.3，病毒滴度= OD260×病毒稀釋倍數×1.1×1012=1.738×1012opu/ml。

圖4 重組腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包裝(×100)

2.4pAd-VP3-hrGFP重組腺病毒在SW480細胞中的表達 將制備的重組腺病毒感染SW480細胞，60 h后可見到明顯的GFP陽性細胞，陽性細胞數量隨著MOI值的升高而增多，免疫印跡結果顯示感染60 h后SW480細胞中可以檢測到VP3蛋白表達，表達量隨病毒MOI值的提高而升高，說明制備的重組腺病毒可有效感染SW480細胞并能在細胞中得到較好的表達，見圖5。

1～4：MOI=300、200、100、0重組腺病毒pAd-VP3-hrGFP在SW480細胞內作用60 h后VP3蛋白的表達圖5 Western印跡法檢測VP3蛋白在SW480細胞中的表達

3 討 論

基因治療是惡性腫瘤治療的新的有效手段，安全有效的基因載體是成功進行基因治療的關鍵。腺病毒既可以感染分裂期細胞，又可以感染增殖期細胞，且可在感染的細胞內獲得高效表達，是當前基因治療最常用的運載工具〔7，8〕。本文所用的腺病毒是經過改良敲除了病毒E1和E3區基因的復制缺陷性雙鏈DNA腺病毒。這種腺病毒失去了復制和致病能力，可安全用作外源基因導入體內的載體，將其轉化到含有E1或E3區基因的細胞如人胚腎AD293細胞內即可進行病毒的大量包裝和復制，其優點在于〔9～11〕：基因結構簡單，背景清楚，制備較容易；基因組不與宿主細胞整合，安全性好；繁殖滴度高，對靜止細胞也能感染；宿主廣泛，感染效率高。

本文首先通過設計5'端帶有pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭質

粒EcoR Ⅴ酶切線性化末端18個堿基的上下游引物對VP3目的基因進行擴增，使得擴增的VP3目的基因產物與線性化穿梭質粒具有相同的黏性末端，二者混合在同源重組酶作用下易發生同源重組形成攜帶VP3基因的pShuttle-VP3-hrGFP重組穿梭質粒，然后將線性化的重組穿梭質粒轉化含腺病毒骨架質粒pAdeasy-1的超感受態大腸桿菌BJ5183，制備重組腺病毒質粒pAd-VP3-hrGFP，通過PCR、抗性基因初篩，酶切電泳及測序等方法對獲得的產物進行鑒定以證實構建的重組腺病毒質粒準確無誤。本文中兩次同源重組過程均在細菌內進行，與細胞內進行比較具有明顯優勢，一是細菌繁殖和同源重組能力強，且對周圍環境要求不嚴，重組效率較高。二是細菌內PCR擴增、質粒抽提、酶切等技術均較在哺乳動物細胞內操作更加簡單，整個操作過程也更加簡便順利〔12〕。

本文制備的重組腺病毒可達到很高滴度，且感染率高，性質較穩定，可有效進入SW480細胞內并能穩定表達，VP3蛋白表達量與病毒感染量呈一定的量效和時效關系。

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2Los M，Panigrahi S，Rashedi I，etal.Apoptin，a tumor-selective killer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009；1793(8)：1335-42.

3劉雪梅，崔 劍，侯偉健，等.TAT-Apoptin融合蛋白分泌表達載體的構建及其活性檢測〔J〕.中國醫科大學學報，2013；42(1)：45-8.

4王劍松，詹 輝，羅群強，等.凋亡素聯合不同化療藥物體外抗膀胱癌效應觀察〔J〕.現代泌尿生殖腫瘤雜志，2010；2(5)：216-9.

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6鄧守恒，陳 萍.PEP-1-VP3融合蛋白的原核表達及純化〔J〕.現代腫瘤醫學，2014；22(9)：2281-4.

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8黃慶娟，朱慧明，王 娜，等.腺病毒介導的凋亡素、內皮抑素雙基因對食管癌的實驗研究〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志，2012；21(5)：423-6.

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12張又莉，徐少勇，王家寧，等.pAd-NY-ESO-1-EGFP的構建及鑒定〔J〕.鄖陽醫學院學報，2008；27(6)：486-9.

〔2016-06-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R285

A

1005-9202(2017)18-4460-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.012

湖北省自然科學基金(No.2008CDZ041)；湖北省衛生廳基金(No.QJX2008-42)

陳 萍(1962-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事腫瘤藥理研究。

鄧守恒(1973-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤藥理研究。