六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠肝、腎和胰腺組織學變化的影響

呂 璐 鄭源強 張精彩 李斯琦 王曉東 尹 星 徐 佳 韓新榮 石艷春

(內蒙古醫科大學自治區分子生物學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010058)

六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠肝、腎和胰腺組織學變化的影響

呂 璐 鄭源強 張精彩1李斯琦1王曉東1尹 星1徐 佳1韓新榮1石艷春

(內蒙古醫科大學自治區分子生物學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010058)

目的探討不同劑量六味地黃丸對自發性2型糖尿病(T2DM)模型小鼠肝臟、腎臟和胰腺組織學變化的影響。方法將6～8周齡自發性T2DM模型小鼠(KK-Ay小鼠)隨機分為無藥對照組、低劑量組和高劑量組，C57BL/6J小鼠作為遺傳對照組。各組小鼠分別給予蒸餾水或六味地黃丸灌胃15 w。給藥15 w后，HE染色觀察小鼠肝臟、腎臟和胰腺組織學變化。結果給藥組小鼠肝臟、腎臟和胰腺組織病變明顯減輕。低劑量組對小鼠肝臟的保護效果優于高劑量組；高劑量組對腎臟病變的治療效果好于低劑量組；低劑量組對胰島內胰島細胞具有明顯的保護作用。結論六味地黃丸對自發性T2DM所致的實驗小鼠肝臟、腎臟和胰腺組織病理性改變具有明顯的改善作用，且與給藥劑量相關。

2型糖尿病；六味地黃丸；肝臟；腎臟；胰腺

2型糖尿病(T2DM)的發病機制、治療措施等研究一直是生命科學研究領域的熱點課題〔1,2〕。T2DM常見并發癥包括腎病、神經病變、眼病及感染等。六味地黃丸常用于糖尿病及其并發癥的治療，可單獨使用或者與西藥聯合用藥，療效明顯〔3,4〕。前期實驗結果表明，六味地黃丸對自發性T2DM模型小鼠(KK-Ay小鼠)高血糖和肥胖具有一定的治療作用，并且能夠降低血清和胰島內胰島素表達水平〔5〕。本研究探討不同劑量六味地黃丸對自發性T2DM模型小鼠肝臟、脾臟和胰腺組織學變化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 濃縮六味地黃丸〔北京同仁堂(集團)有限責任公司〕；組織包埋機(BKJ)、石蠟切片機(LEICA)等。

1.2實驗動物及分組 自發性T2DM模型小鼠(SPF級KK-Ay小鼠，雌性)24只，6～8周齡，隨機分為3組，每組8只，即無藥對照組、低劑量組和高劑量組。C57BL/6J小鼠8只，雌性，6～8周齡。KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠的體質量均為18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。C57BL/6J小鼠作為遺傳對照組。高糖飼料：購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0008。

1.3小鼠灌胃給藥與飼養 各組小鼠購買后先進行2 w適應性飼養，并且全程給予高糖飼料。第3周開始灌胃給藥，各組每只小鼠灌胃0.1 ml/次，2次/d。六味地黃丸用滅菌蒸餾水配成混懸液，低劑量組和高劑量組給藥濃度分別為70 mg/ml和140 mg/ml(按照濃縮六味地黃丸藥品說明書并根據開始灌胃時全部小鼠平均體重為37.51 g，綜合換算給藥量。140 mg/ml是按正常成人給藥劑量換算而得，70 mg/ml為減半給藥劑量)；無藥對照組和遺傳對照組給予等劑量無菌蒸餾水。

1.4小鼠組織臟器的收集、制片及染色 灌胃給藥15 w后，各組小鼠脫頸處死后，常規條件下取肝臟、腎臟和胰腺，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規HE染色，顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1各組小鼠肝臟HE染色檢測結果 與遺傳對照組相比，無藥對照組小鼠肝臟脂肪空泡較多且幾乎所有肝細胞脂肪變性明顯；低劑量組雖然也存在脂肪空泡且極少有肝細胞脂肪變性；高劑量組偶有脂肪空泡，肝細胞脂肪變性也較明顯，部分肝細胞脂肪變性得到改善(圖1)。表明六味地黃丸對T2DM模型小鼠肝臟具有保護作用，且低劑量組對肝細胞脂肪變性的治療效果優于高劑量組。

2.2各組小鼠腎臟HE染色檢測結果 (圖2)遺傳對照組腎臟組織形態正常，腎小球規則，腎小管排列整齊，腎小管上皮細胞形態正常；無藥對照組小鼠腎小球肥大、毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞空泡樣變；給藥組小鼠腎臟病變明顯輕于無藥對照組，且高劑量組更輕，僅有少量腎小管上皮細胞空泡樣變，表明六味地黃丸對T2DM小鼠伴發的腎臟損傷具有改善作用，且高劑量組效果優于其他組。

圖1 各組肝臟HE染色結果(×100)

圖2 各組腎臟HE染色結果(×100)

2.3各組小鼠胰腺HE染色檢測結果 遺傳對照組胰島為形狀規則的橢圓形或圓形的細胞團，界線清楚，胰島內細胞排列緊密。其余組均有胰島代償性增大，且無藥對照組小鼠胰島外形不規則，胰島內組織結構松散，有空虛區域，部分胰島細胞胞質空泡化。給藥組胰島病變均輕于無藥對照組，其中低劑量組仍存在胰島代償性增大，但胰島內細胞排列緊密；高劑量組胰島代償性增大現象得到明顯改善，但胰島內細胞數量較少，存在空虛區域(圖3)。

圖3 各組胰腺HE染色比較(×100)

3 討 論

國際糖尿病聯盟統計數據顯示：2011年全球糖尿病人數已達到3.7億，其中絕大部分存在于發展中國家，預計2035年全球將有近5.31億糖尿病患者〔6〕。我國的流行病學調查顯示：18歲以上人群糖尿病的患病率為9.7%，且以T2DM為主〔7〕。T2DM常伴有腎病、神經病變等并發癥，但其發病機制尚不完全清楚。目前認為慢性低密度炎癥反應是導致糖尿病的主要致病因素。炎癥激活天然免疫系統導致機體長期處于低密度炎癥狀態、脂源性細胞因子及激素分泌紊亂，最終會導致糖尿病及其并發癥的發生〔8,9〕。肝臟作為胰島素作用的靶器官，在T2DM患者體內易發生胰島素抵抗，加重機體代謝紊亂，而該病的脂代謝紊亂是形成非酒精性脂肪肝的獨立危險因素〔10,11〕。糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管病變的嚴重并發癥之一，也是導致終末期腎病及死亡的主要原因〔12〕。

六味地黃丸是中醫治療腎陰虛的基礎方。六味地黃丸(包括加減方)在臨床實踐中常用于輔助治療糖尿病尤其是T2DM及其并發癥，具有較好的治療效果〔13,14〕。KK-Ay小鼠作為典型的自發性T2DM模型小鼠，與人的發病特征相似〔15〕。我們的前期結果顯示，六味地黃丸能夠降低KK-Ay小鼠血清和胰島內胰島素表達水平。在大鼠模型研究中，六味地黃丸也顯示出對大鼠胰腺和胰島β細胞具有保護作用〔16,17〕。糖尿病是一類代謝性疾病，肝臟、腎臟和胰腺的功能狀態與糖尿病及其并發癥的發生、發展與預后密切相關。本研究結果表明，六味地黃丸對糖尿病尤其是T2DM所致的模型動物肝臟、腎臟和胰腺損傷具有保護和治療作用，但確切機制尚待進一步探討。

1Doria A,Patti ME,Kahn CR.The emerging genetic architecture of type 2 diabetes〔J〕.Cell Metab,2008;8(3):186-200.

2Philippe AH,Kenneth SP,Donald WB,etal.β-cell failure in type 2 diabetes:postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment〔J〕.Diabetes Care,2014;37(6):1751-8.

3謝 奇.六味地黃丸在2型糖尿病治療中的作用與研究〔J〕.中醫臨床研究,2013;5(1):116-8.

4李征鋒,陳 喬,何 紅.六味地黃丸輔治2型糖尿病的療效觀察及對神經內分泌網絡的影響〔J〕.江西醫藥,2014;49(9):860-1,866.

5呂 璐,鄭源強,張精彩,等.六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠胰島素表達水平的影響〔J〕.中國免疫學雜志,2016;32(3):350-3.

6Ramachandran A,Snehalatha C,Ma RC.Diabetes in South-East Asia:an update for 2013 for the IDF Diabetes Atlas〔J〕.Diab Res Clin Pract,2014;103(2):231-7.

7中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南(2013年版)〔J〕.中國糖尿病雜志,2014;22(8):2-42.

8Johnson AM,Olefsky JM.The origins and drivers of insulin resistance〔J〕.Cell,2013;152(4):673-84.

9Winer S,Winer DA.The adaptive immune system as a fundamental regulator of adipose tissue inflammation and insulin resistance〔J〕.Immunol Cell Biol;2012;90(8):755-62.

10Nolan CJ,Damn P,Prentki M.Type 2 diabetes across generation：from pathophysiology to prevention and management〔J〕.Lancet,2011;387(9786):169-81.

11Rafiq N,Younossi ZM.Effects of weight loss on nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.Semin Liver Dis,2008;28(4):427-33.

12隋燕霞,解立怡,趙東利.2型糖尿病合并腎損害177例臨床病理分析〔J〕.診斷病理學雜志,2015;22(7):385-9,393.

13丘志峰.使用六味地黃丸治療2型糖尿病腎病的療效分析〔J〕.當代醫藥論叢,2015;13(7):45-6.

14鐘飛鵬,劉笑云.六味地黃丸聯合甲鈷胺治療糖尿病周圍神經病變臨床觀察〔J〕.光明中醫,2013;28(3):560-1.

15Tomino Y.Lessons from the KK-Ay mouse,a spontaneous animal model for the treatment of human type 2 diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Urol Mon,2012;4(3):524-9.

16李 佳,薛耀明,錢 毅,等.六味地黃丸對自發性糖尿病大鼠胰腺的保護作用〔J〕.南方醫科大學學報,2010;30(6):1407-9.

17任雅瑾,馬紅英,陳曉文,等.六味地黃丸對糖尿病大鼠胰島β細胞的保護作用〔J〕.中國中西醫結合消化雜志,2013;21(9):475-8.

〔2017-06-14修回〕

(編輯 曹夢園)

R967

A

1005-9202(2017)18-4455-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.010

內蒙古自治區自然科學基金(2012MS1126)；內蒙古醫科大學英才培育項目資助(2015年)

1 內蒙古醫科大學護理學院

石艷春(1958-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事抗感染免疫與疫苗研究。 韓新榮(1957-)，男，碩士，教授，碩士生導師，主要從事中醫藥與免疫學研究。

呂 璐(1988-)，女，碩士，主要從事抗感染免疫與中藥免疫研究。