葡多酚通過緩解內質網應激改善胰島β細胞功能的機制

王勝麟 肖 武 張海峰

(武漢市第一醫院藥學部，湖北 武漢 430022)

葡多酚通過緩解內質網應激改善胰島β細胞功能的機制

王勝麟 肖 武 張海峰1，2

(武漢市第一醫院藥學部，湖北 武漢 430022)

目的探討葡多酚對胰島素抵抗和胰島β細胞功能的影響及機制。方法從克倫生葡萄提取葡多酚后干預高脂(HDF)喂養小鼠和胰島β細胞株Min-6，檢測內質網應激標志蛋白葡萄糖調節蛋白(GRP)-78、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)GAS5及microRNA(miR)-346表達。通過小分子RNA干擾(siRNA)下調lncRNA GAS5后驗證lncRNA GAS5在葡多酚調節內質網應激和miR-346表達水平中的作用。結果葡多酚可降低HDF動物血糖并改善胰島素抵抗；同時抑制HDF導致小鼠胰腺內質網標志物GRP-78及CHOP升高。葡多酚還上調lncRNA GAS5和下調miR-346。siRNA-lncRNA GAS5可抑制葡多酚介導的GRP-78和miR-346下調。結論葡萄酚通過抑制內質網應激改善胰島素抵抗和胰島β細胞，其抑制內質網應激是通過上調lncRNA GAS5繼而下調miR-346實現的。

葡多酚；內質網應激；胰島素抵抗；長鏈非編碼RNA GAS5；microRNA-346

胰島β細胞功能障礙是糖尿病，特別是糖尿病后期胰島β細胞衰竭的最重要原因。在2型糖尿病(T2DM)發生過程中，早期由于機體對胰島素不敏感，導致脂肪動員增加，血清游離脂肪酸(FFA)增加，對胰島細胞產生脂毒性，成為胰島β細胞功能障礙的重要始動因素；而繼發于脂肪酸及其衍生物的β細胞內質網應激(ERS)〔1，2〕則是導致胰島β細胞障礙的持續機制，是胰島素抵抗(IR)和糖尿病發病的中樞環節。植物多酚是一類主要存在于植物皮、葉和果中的成分復雜的可溶性酚類化合物，多種植物來源的多酚化合物均具有抗氧化、抗炎等作用，部分還具有抗血小板聚集及抑制微生物作用。其中，葡多酚(又名葡萄原花青素，GPC)的作用近年備受關注。近年研究結果顯示，多元酚通過抑制ERS和減少β細胞凋亡改善糖尿病患者β細胞功能，并鑒定出一系列微小RNA(microRNA)和信號通路激酶〔3〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)近年來被證實廣泛參與細胞代謝，但lncRNA在GPC抑制ERS和改善β細胞功能中的作用尚無報道。本研究旨在探討lncRNA在GPC介導的胰島β細胞保護和改善ERS中的作用。

1 材料與方法

1.1動物和細胞 SPF級10周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重30～40 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，分為對照組(NC組，普通飼料喂養)，高脂飼料組(HDF組，高脂飲料喂養)；高脂飼料+GPC酚組(HDF+GPC組，250 mg/kg，見下述)。小鼠胰島β細胞株Min-6購自美國ATCC，使用低糖DMEM培養基，10%胎牛清，1%青、鏈霉素于37℃培養箱以5%CO2培養。使用化學合成siRNA(5′-CUUGCCUGGACCAGCUUAAdTdT-3′，銳博，廣州，中國)，以Lipo RNAiMAX(Thermo Fisher，San Diego，USA)轉染Min-6抑制細胞內lncRNA GAS5表達。

1.2高脂飼料和棕櫚酸 高脂飼料(D12492，60%熱量來源于脂肪)購自廣東省醫學實驗動物中心，棕櫚酸(PA)購于Sigma；PA溶于10% FFA BSA。

1.3GPC萃取、純化和鑒定 GPC根據文獻方法〔4〕制備。取無核克倫生葡萄，曬干并碾碎至粉用萃取法獲得，以GPC標準品(島田株式會社，大阪，日本)為參照，高效液相色譜法測定純度，GPC含量大于99%。

1.4空腹血糖(FPG)、血胰島素(Ins)及胰島素抵抗指數(HOMA-IR) 干預結束后，分別取小鼠禁食10 h及2 g/kg葡萄糖灌胃后，眼球靜脈取血，使用氧電極法于全自動生化儀測定FPG；使用免疫酶聯吸附反應方法測定Ins含量；使用HOMA穩態模型計算HOMA-IR〔FPG(mmol/L)×Ins(mIU/L)÷22.5〕。

1.5逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 取干預結束后動物胰腺或細胞，冰PBS洗滌后置于液氮中碾磨至粉，使用TRIZOL-氯仿法抽提總RNA，商業化逆轉錄試劑盒(寶生物工程有限公司，大連)進行反轉錄后使用SYBR法(寶生物工程有限公司，大連)進行熒光定量。RT-qPCR使用引物：GRP-78正義：5′-CACTATTGCTGGACTGAATG-3′；反義：5′-CCTTGCTTGATGCTGAGA-3′；CHOP正義：5′-GAGGAGGAAGAGCAAGGA-3′；反義：5′-GAGACAGACAGGAGGTGAT-3′；lncRNA GAS5正義：5′-AAGCCATTGGCACACAGGCATTAG-3′；反義：5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；miR-346正義：5′-CTGTGTTGGGCG-TCTGTCTG-3′；反義：5′-GAAGGAGCAGCTCTGCCCAG-3′；β-Tubulin正義：5′-GAACACAGACGAGACCTAC-3′；反義：5′-TCCACCTCCTTCATAGACAT-3′。

1.6Western印跡 按上述方法碾磨至粉后加入細胞裂解液(天根生化科技有限公司，北京)，使用超聲破碎細胞儀勻漿后離心、收集并以BCA法(天根生化科技有限公司，北京)定量上清總蛋白含量。加入上樣緩沖液后進行SDS-PAGE分離，經轉膜、一抗和二抗孵育，加入ECL發光液(Millipore，Massachusetts，USA)后于凝膠成像系統捕獲圖像。

2 結 果

2.1GPC對HDF喂養小鼠FPG及胰島素抵抗(IR)的影響 HDF組空腹及葡萄糖負荷后血糖均高于NC組；基礎胰島素(B-Ins)水平高于NC組，但葡萄糖負荷后胰島素(S-Ins)水平低于NC組；HOMA-IR顯著高于NC組。與HDF組相比，GPC組空腹及血糖葡萄糖負荷后血糖均低于HDF組，B-Ins水平亦低于NC組而葡萄糖負荷后胰島素水平與HDF組相近；HOMA-IR低于HDF組，但仍高于NC組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組血糖、Ins及HOMA-IR比較

與NC組比較：1)P<0.05；與HDF組比較：2)P<0.05

2.2GPC對HDF喂養小鼠胰腺組織ERS標志物的影響及可能機制 見圖1，圖2。與NC組相比，HDF組胰腺分子伴侶葡萄糖調節蛋白(GRP)-78及CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)表達均增高，而GPC可削弱此二者改變(NC組 vs HDF組 vs GPC組：0.13±0.02 vs 0.43±0.04 vs 0.26±0.03)。與NC組(1.0±0.02)相比，HDF組胰腺miR-346表達顯著升高(2.37±0.2)，lncRNA GAS5顯著降低(0.37±0.05)；與HDF組相比，GPC組胰腺lncRNA GAS5表達升高(HDF組0.37±0.05，GPC組0.75±0.09)，miR-346表達降低(HDF組2.37±0.20，GPC組1.68±0.30)。

圖1 CPC對各組胰腺ERS標志物GRP-78、GHOP表達的影響

圖2 GPC對PA刺激的Min-6表達GRP-78、CHOP的影響

2.3lncRNA GAS5在GPC改善ERS影響中的作用 以PA刺激Min-6細胞，檢測GRP-78及CHOP水平(NC組vs NDF組vs GPC組：0.7±0.07 vs 1.3±0.15 vs 0.79±0.08)以及lncRNA GAS5表達水平(HDF組vs GPC組：1.0±0.01 vs 0.46±0.05 vs 0.89±0.9)和miR-346表達(NC組vs HDF組vs GPC組：1.0±0.02 vs 3.95±0.02 vs 2.67±0.3)。與si-scramble相比，siRNA-GAS5可削弱GPC對GRP-78的抑制作用(HDF組vs GPC組：0.16±0.02 vs 0.49±0.09，P=0.01)(圖3)，同時miR-346表達上調(HDF組vs GPC組：1.0±0.04 vs 1.79±0.09，P<0.01)。這就說明，上調lncRNA GAS5是GPC拮抗ERC和抑制miR-346的重要途徑。

圖3 siRNA-GAS5對GRP-78表達的影響

3 討 論

胰島β細胞功能受損是糖尿病發病和持續的核心事件，貫穿了糖尿病發生發展的全過程，而由于IR造成的血清脂肪酸致β細胞脂毒性是胰島β細胞受損的關鍵原因。脂毒性導致胰島β細胞功能障礙機制復雜，ERC在其中的作用是近年研究熱點。本研究通過體內外實驗證實GPC具有改善IR、抑制胰島β細胞ERC的作用；機制實驗進一步證實這種作用，起碼部分由lncRNA GAS5介導。GAS5是早年被報道的非編碼RNA，但其作用機制和功能直到近年才被逐步發現。GAS5早期作為一種細胞抑制增殖因子被認識，在多種腫瘤細胞中表現出強大的抑制作用〔5，6〕。本研究結果顯示GPC改善IR同時上調lncRNA GAS5，這可能不能從GAS5經典作用得到解釋。本研究結果顯示，miR-346與GAS5呈反向表達模式，而前者是ERS的強力促進因素〔7〕。因此，GAS5可能通過非直接作用模式調節ERS和改善IR，而是通過對miR-346抑制實現緩解ERC，從而改善IR。同樣必須注意的是，GPC干預后，lncRNA GAS5升高倍數低，僅不足2倍。因GAS5在細胞內本身豐度較高，這提示可能在這樣的豐度下即可實現對miR-346抑制，而更高的表達豐度可能出現RNA-蛋白質相互作用等，進而發揮抑制胰島素信號通路和細胞生存受損的相反結果。此外，亦有研究顯示GAS5可作為糖皮質激素受體擬似物，競爭結合糖皮質激素，從而抑制糖皮質激素的生物學效應〔8〕，而后者對IR的促進作用已得到廣泛證實。同時，GAS5也可能作為小核仁RNA調節rRNA及核糖體生成調節生命活動〔9〕，但這種機制在改善ERS和IR中是否發揮作用尚不清楚。

GPC的實質是一類具有多元酚結構的可溶性混合物總稱，主要包含了單寧類、黃酮類、酚酸類及花色苷類物質。這種多元酚雖然構成復雜，但因為具有共同的多元酚化學結構，因此有共同作用機制被提出。早年認為，多元酚因具有疏水鍵和多點氫鍵，能夠與蛋白質結合從而調節蛋白質功能；還因酚羥基結構的鄰位酚羥基易被氧化而作為氧化底物中和活性氧以發揮抗氧化作用〔10〕。確實，支持本研究結論的是，玫瑰多酚等亦被證實促進AMPK磷酸化〔3〕，而后者是改善IR重要功能蛋白。GPC調控GAS5作用機制未知，但已有多元酚通過表觀遺傳學修飾調節非編碼RNA報道〔11〕，而甲基化等表觀遺傳修飾又在GAS5表達中發揮重要作用〔12〕。但GPC是否通過改變GAS5啟動子區域DNA甲基化發揮作用仍需要研究進一步證實。

1Clark AL，Urano F.Endoplasmic reticulum stress in beta cells and autoimmune diabetes〔J〕.Curr Opin Immunol，2016；43：60-6.

2Hasnain SZ，Prins JB，McGuckin MA.Oxidative and endoplasmic reticulum stress in β-cell dysfunction in diabetes〔J〕.J Mol Endocrinol，2016；56(2)：R33-54.

3Joven J，Espinel E，Rull A，etal.Plant-derived polyphenols regulate expression of miRNA paralogs miR-103/107 and miR-122 and prevent diet-induced fatty liver disease in hyperlipidemic mice〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1820(7)：894-9.

4Li JH，Liu S，Zhou H，etal.Starbase v2.0：decoding miRNA-ceRNA，miRNA-ncRNA and protein-RNA interaction networks from large-scale CLIP-Seq data〔J〕.Nucleic Acids Res,2014;42：92-7.

5Xue Y，Ni T，Jiang Y，etal.LncRNA GAS5 inhibits tumorigenesis and enhances radiosensitivity by suppressing mir-135b expression in non-small cell lung cancer〔J〕.Oncol Res,2017:epub.

6Xue D，Zhou C，Lu H，etal.LncRNA GAS5 inhibits proliferation and progression of prostate cancer by targeting miR-103 through AKT/mTOR signaling pathway〔J〕.Tumour Biol,2016;37(12):16187-97.

7Bartoszewski R，Brewer JW，Rab A，etal.The unfolded protein response (UPR)-activated transcription factor X-box-binding protein 1 (XBP1) induces microRNA-346 expression that targets the human antigen peptide transporter 1 (TAP1) mRNA and governs immune regulatory genes〔J〕.J Biol Chem,2011;286(48)：41862-70.

8Xu C，Zhang Y，Wang Q，etal.Long non-coding RNA GAS5 controls human embryonic stem cell self-renewal by maintaining NODAL signalling〔J〕.Nat Commun,2016;7：13287.

9He X，Chen X，Zhang X，etal.An Lnc RNA (GAS5)/SnoRNA-derived piRNA induces activation of TRAIL gene by site-specifically recruiting MLL/COMPASS-like complexes〔J〕.Nucleic Acids Res,2015;43(7)：3712-25.

10Sureda A，Tejada S，Bibiloni MM，etal.Polyphenols：well beyond the antioxidant capacity：polyphenol supplementation and exercise-induced oxidative stress and inflammation〔J〕.Curr Pharm Biotechnol,2014;15(4)：373-9.

11Oliveras-Ferraros C，Fernández-Arroyo S，Vazquez-Martin A，etal.Crude phenolic extracts from extra virgin olive oil circumvent de novo breast cancer resistance to HER1/HER2-targeting drugs by inducing GADD45-sensed cellular stress，G2/M arrest and hyperacetylation of Histone H3〔J〕.Int J Oncol,2011;38(6)：1533-47.

12Zhang N，Wang AY，Wang XK，etal.GAS5 is downregulated in gastric cancer cells by promoter hypermethylation and regulates adriamycin sensitivity〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016;20(15)：3199-205.

〔2017-04-17修回〕

(編輯 徐 杰)

Grapeprocyanidinsameliorateinsulinresistanceandimproveβ-cellfunctionviaattenuationofendoplasmicreticulumstressWANGSheng-Lin,XIAOWu,ZHANGHai-Feng.

DepartmentofPharmacy,No.1HospitalofWuhan,Hubei430022,Wuhan,China

ObjectiveTo explore the effects of grape procyanidins (GPC) on insulin resistance (IR) and β-cell function.MethodsGPC was extracted from plants (crimson grape), which was administrated to HDF diet induced IR in mice. GRP-78 and CHOP were detected to reflect magnitude of endoplasmic reticulum stress (ERS). Long non-coding RNA GAS5 (lncRNA GAS5) and microRNA-346 (miR-346) were also measured. Small interference RNA (siRNA) against lncRNA GAS5 was used to verify the increased levels of lncRNA GAS5 and to explore its role in GRP-78 and miR-346 regulations by GPC.ResultsGPC lowered blood glucose and released IR, which was accompanied by lower levels of ERS markers of GRP-78 and CHOP. Expression of lncRNA GAS5 was up-regulated while miR-346 was down-regulated by GPC. siRNA-lncRNA GAS5 reversed the GRP-78 and miR-346 down-regulations by GPC.ConclusionsGPC could ameliorate IR through attenuation of ERS, which is mediated by up-regulation of lncRNA GAS5 and subsequently inhibition of miR-346.

Grape procyanidins; Endoplasmic reticulum stress; Insulin resistance; Long non-coding RNA GAS5, microRNA-346

R587

A

1005-9202(2017)18-4432-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.002

國家自然科學基金項目(81300071)；廣東省自然科學基金項目(2014A030313049)；廣東省醫學科研基金項目(A2014229，A2015019，A2016270)；廣州市科技計劃項目(201510010048，201510010050)

1 中山大學孫逸仙紀念醫院 2 廣東省心電生理與心律失常實驗室

張海峰(1982-)，男，博士，主治醫師，主要從事脂肪酸代謝及脂毒性研究。

王勝麟(1967-)，男，藥劑師，主要從事藥學研究。