基于氧化型谷胱甘肽保護的熒光金納米團簇的制備及其對Fe3+的檢測

董 哲，謝立娟，李 陽,2，李碧野，李 丹，席海山

(1.內蒙古民族大學 天然產物化學及功能分子合成自治區重點實驗室，內蒙古 通遼 028043; 2.通遼市醫院骨一科，內蒙古 通遼 028000)

基于氧化型谷胱甘肽保護的熒光金納米團簇的制備及其對Fe3+的檢測

董 哲1*，謝立娟1，李 陽1,2，李碧野1，李 丹1，席海山1

(1.內蒙古民族大學 天然產物化學及功能分子合成自治區重點實驗室，內蒙古 通遼 028043; 2.通遼市醫院骨一科，內蒙古 通遼 028000)

利用氧化型谷胱甘肽作為還原劑和穩定劑，通過綠色合成法制備了具有良好生物相容性的金納米團簇(GSSG-Au NCs)，其平均粒徑大小為2.9 nm。以其為熒光探針實現了對Fe3+的高靈敏檢測，且對干擾離子具有高度選擇性，線性范圍寬 (0.1～30 μmol/L)，檢出限為0.03 μmol/L。該方法用于實際水樣(自來水、湖水和河水)中Fe3+的測定，結果滿意。

金納米團簇；氧化型谷胱甘肽；熒光探針；鐵離子

鐵是生物體所必需的微量元素之一，也是人體中含量最豐富的過渡金屬，為細胞代謝和基因表達調控提供了必要條件[1]。許多酶均是通過Fe3+來維持其生物活性，生物機體內Fe3+缺乏或攝入過多，可能會引起多種生理疾病甚至死亡[2]。因此，高選擇性和高靈敏地檢測Fe3+具有十分重要的意義[3]。目前，痕量檢測Fe3+的方法主要有離子色譜法、原子發射光譜法、原子吸收光譜法、伏安法和電感耦合等離子體質譜法等，但這些方法存在儀器運行成本較高、維護繁瑣等缺點，限制了其廣泛應用[3-4]。

貴金屬納米團簇具有生物毒副作用低、化學及光穩定性強、斯托克斯位移大、量子產率高等優點，近年來在生化分析領域引起廣泛關注[5-6]。金納米團簇作為分析靈敏度高及線性檢測范圍寬的熒光探針，近年來廣泛應用于重金屬和生物蛋白等的檢測[7-10]。基于金納米團簇材料的熒光分析方法具有操作簡便和靈敏度高等優點，在生物醫學傳感器、納米電子、新型催化劑、光電納米器件等領域擁有廣闊的應用前景。谷胱甘肽是一種含有γ-谷酞基和巰基(—SH)的三肽化合物，機體內一般以還原型(GSH)形式存在，具有一定生物活性，氧化應激后形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)[11-12]。本實驗設計合成了基于GSSG保護的水溶性熒光金納米團簇，并對水樣中的Fe3+進行檢測，該探針響應靈敏，可用于實際水樣中鐵離子的測定，對Fe3+快速檢測具有潛在的應用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

透射電子顯微鏡(JEM-2100F，日本電子)，動態光散射儀(Dynapro，美國懷雅特)，熒光分光光度計(970CRT，上海精科)，紫外可見分光光度計(UV-Vis 8453，美國安捷倫)，熒光壽命測試系統(FL-TCSPC，法國堀場)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101，金壇區岸頭林豐實驗儀器廠)。

氯金酸(HAuCl4)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2-(N-嗎啡啉)乙烷磺酸鈉(MES)購于阿拉丁(Aladdin)試劑中國有限公司；其它所用試劑均為國產分析級，購于長春鼎國生物技術有限責任公司，未經進一步純化。實驗用水由Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超純水系統(Millipore,Biocel)制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 GSSG-Au NCs的合成參考Guo等[13-14]的制備方法并加以適當修改：在圓底燒瓶中分別加入5 mL的HAuCl4溶液(5.0 mmol/L)，在冰浴中磁力攪拌下，將5 mL的GSSG溶液(2.0 mmol/L)逐滴加入到燒瓶中。將溶液不斷攪拌20 min后，再逐滴加入10 mL的0.1% NaBH4溶液，然后快速加入1 mL 0.50 mol/L的NaOH溶液。撤掉冰浴的保護后，再不斷攪拌8 h。對所得混合溶液施加總功率為90 W的超聲波10 min，避光靜置3 h后得到黃棕色溶液。所得GSSG-Au NCs用錫箔紙包好，置于4 ℃冰箱內避光儲存備用[15-16]。

1.2.2 Fe3+的熒光檢測將100 μL的Fe3+溶液(濃度為0.5～800 μmol/L)加入到調配好的GSSG-Au NCs溶液中(30 μL的GSSG-Au NCs溶液，200 μL的MES緩沖溶液和1 670 μL的水溶液)，每次混合搖勻后均靜置30 min。在室溫下，熒光強度測定時的激發波長為361 nm，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。考察不同金屬離子對GSSG-Au NCs的熒光猝滅情況，驗證熒光探針檢測Fe3+的選擇性。

2 結果與討論

2.1 GSSG-Au NCs制備條件的優化

2.1.1反應時間的選擇依照“1.2.1”合成方法，撤掉冰浴后繼續攪拌，每隔一段時間測定產品的熒光值，在反應過程中所合成的GSSG-Au NCs熒光強度在第16 h后達到最大，但與攪拌8 h的產品所發出的熒光相差不大。考慮到能源消耗效率，確定最佳反應時間為8 h。

2.1.2反應物濃度最佳比例依照“1.2.1”合成方法，考察了不同濃度比的反應物對金納米團簇合成的影響。分別加入5 mL不同濃度的HAuCl4溶液(0.5、2.5、5.0、10、20 mmol/L)，GSSG溶液用量為5 mL，濃度為2.0 mmol/L。實驗發現5 mL HAuCl4溶液濃度為5.0 mmol/L時，所合成的金納米團簇樣品熒光值達到最大。

圖1 GSSG-Au NCs的TEM光譜圖 Fig.1 Typical TEM images of GSSG-Au NCsinsert: the size distributions

2.2 GSSG-Au NCs的熒光特性

2.2.1 GSSG-Au NCs的形貌特征考察了所制備熒光GSSG-Au NCs的形態和尺寸分布，分別用透射電子顯微鏡(TEM)和動態光散射儀(DSL)進行了表征。如圖1所示，粒子呈球狀，分散性良好，平均粒徑為2.9 nm。所制備的金納米團簇在400 nm處出現制備樣品特有的等離子體共振吸收峰(圖2插圖)。采用羅丹明作為基準物質(在水中的量子產率為0.31%)，測得GSSG-Au NCs熒光量子產率為2.71%。以上結果表明,已成功合成了穩定性好和量子產率高的熒光GSSG-Au NCs。

2.2.2 GSSG-Au NCs的激發與發射光譜所合成的金納米團簇的熒光激發-發射光譜如圖2所示，其激發光譜峰的λem在672 nm處，最大熒光發射光譜峰λex在361 nm處。該金納米團簇的激發光譜連續，同時具有很寬的熒光激發波長范圍(260～430 nm)，熒光發射峰峰形對稱，半峰寬較窄，熒光強度高，合成出的金納米團簇光學性質穩定，有良好的發光性能。

圖2 GSSG-Au NCs的激發光譜及發射光譜 Fig.2 The excitation and emission spectra of GSSG-Au NCsinsert:UV-Vis absorption spectrum

圖3 GSSG-Au NCs對不同金屬離子的熒光響應情況Fig.3 Sensitivity of the GSSG-Au NCs based assay towards different metal ions

圖4 加入不同濃度Fe3+時GSSG-Au NCs的熒光光譜圖Fig.4 The fluorescence spectra of GSSG-Au NCs with different concentrations of Fe3+

2.2.3 GSSG-Au NCs的穩定性為考察GSSG-Au NCs作為熒光探針的穩定性，研究了其在不同鹽濃度條件下的熒光光譜，發現GSSG-Au NCs的熒光強度在高鹽濃度條件下(100 mmol/L NaCl)幾乎不受影響。實驗還對GSSG-Au NCs樣品的熱穩定性能進行了研究，結果表明GSSG-Au NCs的熒光值在4～95 ℃范圍內變化不大，表明所制備的探針具有較好的結構穩定性。另外，考察了所合成的探針對Fe3+的熒光強度隨時間的變化，結果表明該探針具有較好的時間穩定性。同時考察了GSSG-Au NCs的熒光衰減曲線，計算得到其平均熒光壽命為1.572 ns[18]。

2.3 GSSG-Au NCs對Fe3+的選擇性

2.3.1 GSSG-Au NCs對不同金屬離子的響應情況本文考察了可能存在的金屬離子對GSG-Au NCs熒光強度的影響。如圖3所示，其他實驗條件相同，當體系中分別加入等濃度(10 μmol/L)的不同金屬離子時，Fe3+對該GSSG-Au NCs熒光表現出很強的猝滅效應，而其他金屬離子只會引起較微弱的猝滅效應。

2.3.2 GSSG-Au NCs測定Fe3+的干擾試驗固定Fe3+濃度為10 μmol/L，在檢測體系中分別加入100 μmol/L的干擾金屬離子。結果顯示，Al3+、Cr3+、Hg2+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+、Na+、Ag+、Fe2+等金屬離子對檢測無干擾，表明該方法檢測鐵離子具有較高的選擇性，可用于實際環境水樣中Fe3+的檢測。

2.3.3 GSSG-Au NCs對Fe3+檢測的工作曲線與檢出限在優化實驗條件下，采用GSSG-Au NCs在水體系中對不同濃度的Fe3+進行測定，以此驗證本方法的靈敏度和線性范圍。從圖4中可知，隨著Fe3+濃度的增加，GSSG-Au NCs在水體系中的熒光強度不斷下降。在優化條件下,Fe3+濃度在0.1～30 μmol/L范圍內與熒光強度變化值呈良好的線性關系，其回歸方程為(IF0-IF)/IF=0.057 4C+0.138(r2=0.996)。以3σ/k[17]計算熒光探針的檢出限為0.03 μmol/L。

2.4 實際水樣中Fe3+的檢測

為驗證本方法的實用性，采用合成的GSSG-Au NCs熒光探針測定實際水樣(包括自來水、湖水和河水)中Fe3+濃度，并同時用ICP-AES 法平行測定。實際水樣經簡單的過濾除沉操作后直接用于鐵離子的檢測。每種水樣中分別加入4.0、8.0、12.0 μmol/L的Fe3+，然后將含有不同濃度Fe3+的實際水樣加入到GSSG-Au NCs溶液中，攪拌后靜置30 min測定體系的熒光強度，每組分別測定3 次取其平均值，計算相對標準偏差(RSD)，同時進行樣品加標回收率的測定，結果見表1。兩種方法測得Fe3+濃度的結果一致，加標回收率為82.5%～102.5%，RSD為1.7%～3.7%。說明本方法測定Fe3+濃度的準確性和可靠性符合要求。

表1 水樣中Fe3+濃度的含量測定Table 1 Determination of Fe3+ in water samples

3 結 論

本文在水溶液中利用環境友好的生物小分子作為還原劑和穩定劑，一步法制備了熒光金納米團簇，可以簡便和迅速地測定溶液中Fe3+的濃度。通過優化實驗條件，確定了最佳合成條件，并考察了本方法的特異性、檢測范圍和靈敏度，其檢出限達0.03 μmol/L。所構建的方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單等特點，同時具有較強的準確度和精密度，可應用于實際水樣的測定。

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Synthesis of a Fluorescent Gold Nanoclusters Probe Based on GSSG and Its Application in Determination of Fe3+

DONG Zhe1*,XIE Li-juan1,LI Yang1,2,LI Bi-ye1,LI Dan1,XI Hai-shan1

(1.Key Laboratory for the Natural Products Chemistry and Functional Molecular Synthesis，Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028043,China; 2.Orthopedics One，Tongliao City Hospital,Tongliao 028000,China)

Gold nanoclusters were synthesized based on oxidized glutathione(GSSG) with a mean diameter of 2.9 nm.The fluorescence of GSSG-Au NCs was strongly quenched when Fe3+ions were present.The sensor was used to detelt Fe3+ions has a wide linear range of 0.1-30 μmol/L,a high sensitivity of 0.03 μmol/L and a good selectivity.The method described was successfully applied in real sample(tap water,lake water and river water samples) determination.

gold nanoclusters(Au NCs); oxidized glutathione(GSSG); fluorescent probe; Fe3+

O433.4

：A

：1004-4957(2017)09-1155-04

2017-04-28；

：2017-05-31

國家自然科學基金(21661026)；內蒙古民族大學大型儀器功能開發創新基地資助項目

*

：董 哲，博士，實驗師，研究方向：無機生物，Tel: 0475-8314847，E-mail：dongzhe@imun.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.018