UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS同步檢測十字花科植物中的游離氨基酸

沈 麗，王 超，陳 靜，楊 雪

(北京物資學院 物流學院，北京 101149)

UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS同步檢測十字花科植物中的游離氨基酸

沈 麗*，王 超，陳 靜，楊 雪

(北京物資學院 物流學院，北京 101149)

采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜聯用技術(UHPLC-Quadrupole/Orbitrap MS)結合柱前衍生法建立了可同時測定28種游離氨基酸的分析方法，并對十字花科植物中的游離氨基酸進行檢測和分析。樣品用超純水提取后，經6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)衍生，采用Waters BEH C18柱作為色譜柱，以pH 5.0乙酸銨緩沖溶液和80%乙腈水溶液作為流動相進行梯度洗脫。質譜檢測器采用電噴霧離子源，在正離子模式下進行檢測。實驗結果表明，十字花科植物中含有25種以上游離氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸。25種氨基酸在線性范圍內相關性良好，平均加標回收率為80.5%～104.4%，相對標準偏差為0.6%～4.4%。不同氨基酸檢測靈敏度不同，定量下限為0.01～1.45 μmol/L。該方法雜質干擾小，分析速度快，靈敏度高，適用于植物樣品中游離氨基酸的同步檢測。

超高效液相色譜；高分辨質譜；游離氨基酸；十字花科植物

氨基酸是生物體內構成蛋白質分子的基本單位，與生物的生命活動有著密切關系[1]。為適應人體新陳代謝的需要，人們必須從食物中攝取所需氨基酸。植物作為人類重要的食物來源，是人類獲取氨基酸的主要途徑之一[2]。同時，氨基酸還是蛋白質的分解產物，植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進行運輸，測定植物體內氨基酸的含量有助于研究植物在不同條件下及不同生長發育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化等[3]。氨基酸在植物體內以游離態存在[4]，因此，測定植物體內游離氨基酸的含量具有重要意義。

早期主要采用氨基酸分析儀對游離氨基酸進行檢測[5]，但由于氨基酸分析儀具有結構復雜、價格昂貴、測定時間長和靈敏度較低等缺點，分析工作者開發了一系列新方法來測定植物樣品中的游離氨基酸，包括氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8]、毛細管電泳法[9-10]、氣相色譜-串聯質譜法[11]以及高效液相色譜-串聯質譜法[12-13]等。其中，反相高效液相色譜法因具有操作程序簡單、運行時間短、靈敏度較高等特點，廣泛應用于植物樣品中游離氨基酸的檢測。由于氨基酸極性較強，缺少可產生紫外吸收或熒光信號的基團，應用液相色譜法進行檢測時需對氨基酸進行柱前衍生[14]。常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)、異硫氰酸苯酯(PITC)、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)等[15]。已報道的柱前衍生結合反相高效液相色譜法最多能實現22種游離氨基酸的同步檢測，檢出限在mg/L量級。由于氨基酸是一類化學性質相似的生物活性物質，檢測方法的靈敏度對分析的準確性起非常重要的作用。因此，建立能同步檢測更多種游離氨基酸、靈敏度更高、準確性更好、快速高效的氨基酸分析方法非常必要。

本文建立了一種柱前衍生/超高效液相色譜-高分辨質譜聯用快速檢測植物中游離氨基酸的方法，能同時檢測多達28種氨基酸。所采用的衍生劑為AQC。AQC能同時與一級、二級氨基酸反應，且衍生時間較短，產物穩定性強，有較高的靈敏度，檢出限低[15]，非常適合作為氨基酸檢測的衍生劑。本文以十字花科最簡單的植物——擬南芥作為代表，對上述方法應用于植物樣品檢測的條件進行優化，實現了油菜、香菜、生菜、油麥菜等十字花科植物中游離氨基酸的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Thermo Scientific Q-Exactive超高分辨質譜儀(美國Thermo Scientific公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；5418 高速離心機(德國Eppendorf 公司)；FreeZone凍干機(美國Labconco公司)；Vortex Genius 3渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水器(默克化工技術上海有限公司)。

WATERS AccQ-Fluor試劑盒(衍生劑粉2A、硼酸緩沖液、稀釋液2B,Waters公司)；氨基酸標準混合溶液(Sigma-Aldrich公司)；乙酸銨(分析純)、乙醇(色譜純)、乙酸(色譜純)和乙腈(色譜純)均購自國藥集團北京試劑公司。

擬南芥植物來自于實驗室溫室內種植；油菜、油麥菜、香菜、生菜等蔬菜購自市場。

氨基酸儲備液濃度為450 μmol/L，使用時逐級稀釋，使之濃度為100、20、5、1、0.5 μmol/L。

1.2 實驗方法

1.2.1超高效液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UHPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱溫40 ℃；流動相:A為20 mmol/L乙酸銨溶液(pH 5.0)，B為80%乙腈水溶液；梯度洗脫程序:0.00～3.06 min，97%～93% A；3.06～3.86 min，93%～88% A；3.86～3.89 min，88%～85% A；3.89～8.06 min，85%～66%A；8.06～12 min，66%～30% A；12～15 min，30% A；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.2質譜條件離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式；質譜掃描方式：一級全掃描(分辨率70 000)和靶標二級掃描(分辨率35 000)；電離電壓：3.5 kV；毛細管溫度320 ℃；霧化氣溫度350 ℃；鞘氣流量30 L/min，輔助氣流量10 L/min，反吹氣流量5 L/min。

1.2.3樣品前處理方法將植物樣品用超純水洗凈，在液氮條件下保存。從液氮中取出的植物樣品放入真空冷凍干燥機中，直至樣品干燥完全(約1.5 d)。選取干燥后的植物，去除根部后，全植株剪碎，并在研缽中充分研磨均勻。稱取20 mg樣品于離心管中，加1 mL超純水提取，常溫超聲30 min后，離心10 min(5 000 r/min)，取上清液備用。

1.2.4衍生程序采用AQC為柱前衍生劑。取10 μL樣品提取液置于衍生瓶中，加入70 μL硼酸鹽緩沖液(Buffer 1)，混勻后加入20 μL衍生劑。室溫放置1 min，置于55 ℃烘箱中，衍生10 min。取出冷卻至室溫后，裝瓶上機待測。

2 結果與討論

2.1 質譜與色譜條件的優化

為獲得更高的選擇性和靈敏度，對質譜條件包括離子模式、碎裂電壓、離子源溫度、鞘氣流量及碰撞能量等參數進行了優化。結果顯示，正離子模式下，各氨基酸的分子離子均為[M+H]+。正離子模式下各氨基酸的特征碎片離子如表1所示。

表1 28種待測氨基酸的保留時間、質譜參數、線性范圍、相關系數及定量下限Table 1 Retention times,mass spectrometric parameters,linear ranges,correlation coefficients and quantitation limits of 28 amino acids

圖1 28種氨基酸混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of amino acids mixed standard solution

為獲得更好的分離效果，對色譜柱、流動相組成以及進樣體積等色譜參數進行了優化。比較了BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 和HILIC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 2種色譜柱，發現采用BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 能夠得到較好的保留時間和峰形。因此，選擇BEH C18柱作為分離柱。對于流動相，主要對乙酸銨濃度和溶液pH值進行優化。實驗結果表明，當乙酸銨濃度在10～50 mmol/L范圍時，所有氨基酸的峰形和峰強度基本不變。當乙酸銨濃度低于10 mmol/L時，多數氨基酸的峰強度下降，而乙酸銨濃度過高會對儀器系統產生不利影響，降低色譜柱的使用壽命。另外，通過優化發現流動相為弱酸性時所得信號較好，因此將流動相A的pH值設為5.0，濃度在10～50 mmol/L范圍內均可。本實驗選擇的乙酸銨濃度為20 mmol/L。對進樣體積進行優化時發現，進樣體積超過2 μL時，氨基酸的分離度變差。在優化條件下，28種氨基酸的總離子流圖如圖1所示。

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1樣品干燥方法新鮮植物樣品的含水量高，在檢測之前需將樣品進行干燥處理。本實驗采用烘箱烘干和真空冷凍干燥兩種方式對擬南芥樣品進行處理，氨基酸測定含量為3個批次實驗的平均值，結果如表2所示。通過實驗比較發現，樣品經凍干處理后，大多數氨基酸的含量比樣品經烘干處理后測得含量高，且相對標準偏差(RSD)較小。因此，冷凍干燥法可以更大限度的保留植物體內氨基酸含量，本文選擇真空冷凍干燥法對植物樣品進行處理。

表2 干燥方法對擬南芥中氨基酸含量測定的影響(μmol/g干重)Table 2 Effects of drying methods on the determination of amino acids in arabidopsis(μmol/g dry weight)

2.2.2樣品提取液與提取溫度的選擇植物樣品成分復雜，可能含有對氨基酸檢測產生干擾的成分，因此需選擇合適的提取液使基質干擾最小。實驗分別以1 mL乙醇和超純水作為提取劑，在0、25、70 ℃條件下對10 mg擬南芥植物樣品超聲處理30 min后，采用本方法測定游離氨基酸含量。對比發現，以超純水作為提取劑所測得的氨基酸含量較高，且不同超聲溫度下，氨基酸含量的測定值無明顯差異，樣品提取實驗在室溫下進行即可。此外,以5%磺基水楊酸溶液作為稀酸溶液的代表，對擬南芥植物中的氨基酸進行提取。結果表明，磺基水楊酸稀溶液和純水對各氨基酸的提取效果整體相當，但純水提取后所得溶液顏色更清亮，因此本實驗選用純水作為提取劑。

2.2.3樣品與提取液比例優化分別稱取擬南芥樣品10、20、30 mg溶于1 mL提取液中，按照上文所述步驟進行分析檢測，結果顯示樣品質量分別為10 mg和20 mg時，所測得的游離氨基酸含量比值約為1∶2，但當樣品質量為30 mg時，所測得的游離氨基酸含量與10 mg樣品所測得的游離氨基酸含量比值小于1∶3，說明1 mL提取液不能將30 mg樣品中的氨基酸提取完全。因此最終選擇將20 mg樣品溶于1 mL提取液中。

2.3 方法評價

2.3.1標準曲線與定量下限(LOQ) 采用分辨率為70 000的高分辨質譜儀來識別氨基酸；每種母離子色譜圖的提取窗口設置為3 ppm來減少干擾。以各濃度下化合物的定量離子峰面積對濃度作線性回歸得標準曲線，以10倍信噪比時的濃度計算定量下限(LOQ)，結果如表1所示。每種化合物的峰面積對相應濃度呈良好的線性關系，相關系數(r2)不低于0.995，LOQ為0.01～1.45 μmol/L，能夠滿足檢測要求。

2.3.2準確性與精密度方法的準確度通過擬南芥植物樣品添加已知量標準品所得回收率來考察，精密度則由回收率的RSD來反映。分別向樣品中添加低濃度和高濃度的含有谷氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、脯氨酸5種氨基酸的混合標準品，每批次每個濃度設3個平行。以上5種氨基酸在化學性質、極性等方面差異較大，在植物樣品內的含量也相差較大，可以代表絕大部分氨基酸。如表3所示，3個加標濃度的回收率為80.5%～104.4%，RSD為0.6%～4.4%，證明該方法重現性較好。

表3 5種氨基酸的回收率和相對標準偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 5 amino acids in spiked samples(n=3)

表4 實際樣品中游離氨基酸分析結果(μmol/g干重)Table 4 Determination results of free amino acids in real samples(μmol/g dry weight)

*no detection

2.4 實際樣品分析

將該方法應用于市售油菜、油麥菜、香菜、生菜等4種十字花科植物中游離氨基酸含量的檢測。分別采用外標法和內標法(以正亮氨酸為內標物)進行定量分析，經比較發現，內標法與外標法所得結果差別不大，說明兩種方法均可用于植物中游離氨基酸的定量檢測。因外標法比內標法更加簡便，選擇外標法進行定量分析，結果如表4所示。由此可見，4種蔬菜中含有豐富的游離氨基酸，油菜的氨基酸含量最高，其次是香菜、生菜、油麥菜。4種蔬菜中全部含有色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸8種人體必需氨基酸，其中以油菜含量最高。

3 結 論

利用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術結合AQC柱前衍生法建立了植物中游離氨基酸的快速檢測方法。本方法將現有柱前衍生/RPHPLC方法的分析指標擴展到28個。通過優化色譜、質譜條件以及樣品前處理方法，使檢測更加便捷與準確。通過對十字花科植物中游離氨基酸的檢測，發現植物中含有超過25種游離氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，進一步證實了十字花科植物的營養價值。

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Detection of Free Amino Acids in Cruciferous Vegetables by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

SHEN Li*,WANG Chao，CHEN Jing,YANG Xue

(Logistics School,Beijing Wuzi University,Beijing 101149,China)

A simultaneous method was developed for the analysis of 28 free amino acids using ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry with pre-column derivatization,and was used to detect the free amino acids in cruciferous plants.The samples were extracted using ultra-pure water,and derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC) to enhance chromatographic retention.A Waters BEH C18column was used as stationary phase.Ammonium acetate solution(pH 5.0) and 80% acetonitrile in water were applied as mobile phases for gradient elution.MS detector with electrospray ion source worked in positive ion mode.The results showed that there were more than 25 kinds of free amino acids in cruciferous plants,including 8 essential amino acids.All calibration curves of the analytes exhibited good linearity.The average recoveries of this method ranged from 80.5% to 104.4% with the relative standard deviations of 0.6%-4.4%.The sensitivities of amino acids were different,and the quantitation limit was between 0.01 μmol/L and 1.45 μmol/L.With the advantages of little impurity interference,rapidness and high sensitivity,the method is suitable for the simultaneous detection of free amino acids in plant samples.

ultra-high performance liquid chromatography;high resolution mass spectrometry;free amino acids;cruciferous vegetables

O657.63；Q517

:A

：1004-4957(2017)09-1093-06

2017-04-13；

：2017-05-25

北京市科技新星計劃資助項目(2013028)；中國商品學會規劃項目(SPXH201601)

*

：沈 麗，博士，副教授，研究方向：商品檢驗與質量管理，Tel:010-89534018，E-mail:lishen97@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.006