清熱祛瘀方對慢性盆腔炎模型大鼠血流動力學及免疫分子的影響*

王新斌，薛淑萍，馬睿玲，劉峰林，顏春魯，吳國泰

(1.甘肅中醫藥大學, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州市中醫院婦產科，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

清熱祛瘀方對慢性盆腔炎模型大鼠血流動力學及免疫分子的影響*

王新斌1，薛淑萍2，馬睿玲1，劉峰林1，顏春魯1，吳國泰1

(1.甘肅中醫藥大學, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州市中醫院婦產科，甘肅 蘭州 730000)

目的:探討清熱祛瘀方對慢性盆腔炎模型大鼠血流動力學及免疫分子的作用。方法: 將60只Wistar雌性大鼠隨機分為假手術組，模型對照組，清熱祛瘀方高(21.0 g/kg)、中(10.5 g/kg)、低(5.3 g/kg)劑量組及金剛藤膠囊組(0.63 g/kg )6組。除假手術組外,其他各組通過苯酚膠漿注入大鼠子宮法建立盆腔炎大鼠模型。造模成功后第8天開始，依據人與大鼠用藥量換算方法[4]計算用藥量，金剛藤組灌胃給予金剛藤溶液 0.63 g/kg，清熱祛瘀方高、中、低劑量組依次灌胃給予清熱祛瘀方 21.0，10.5 ，5.3 g/kg，模型對照組及假手術組蒸餾水給予10μL/g灌胃，1 d 1 次，共4周。檢測大鼠子宮腫脹程度、血流動力學、血清白介素(IL-10)與腫瘤壞死因子(TNF-α)及免疫球蛋白(IgG、IgA)的影響。結果:清熱祛瘀方可明顯緩減子宮組織病理變化而減輕子宮水腫，降低血清TNF-α含量水平，提高血清IL-10、IgG、IgA的表達；同時，還能明顯改善血流動力學的相關指標(P<0.05)。結論:清熱祛瘀方能調節免疫分子及改善大鼠血流動力學，減輕盆腔炎子宮水腫及病變，這可能是其防治盆腔炎的機制之一。

清熱祛瘀方/藥效學；盆腔炎；血流動力學；IL-10；TNF-α； IgA； IgG；子宮腫脹度；腫脹抑制率；動物；大鼠

盆腔炎(pelvic inflammatory diseases,PID)[1]是指女性生殖器包括子宮、輸卵管、卵巢及其周圍的結締組織、盆腔腹膜炎癥的總稱，是性活躍期女性常見的上生殖道感染性疾病。若急性期治療不徹底、炎程遷延或病人體質差，會形成慢性型盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease,CPID)。依據盆腔靜脈叢解剖學特點，CPID多形成盆腔靜脈曲張，發展為盆腔淤血綜合征，對女性的身心健康造成嚴重影響。清熱祛瘀方是甘肅中醫藥大學附屬醫院婦科用于治療慢性盆腔炎的協定方劑，目前對該方的研究只限于臨床療效觀察和藥效動力學研究。本研究通過復制盆腔炎大鼠模型，觀察清熱祛瘀方對慢性盆腔炎模型大鼠血流動力學及免疫分子的影響，進一步探討其治療慢性盆腔炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級Wister雌性大鼠，鼠齡10～14周，體質量(215.82±16.26) g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(甘) 2004-0006-0000010。

1.2 藥品、試劑與儀器

清熱祛瘀方由紅藤、土茯苓、野菊花、乳香、沒藥、延胡索、五靈脂、丹參、 赤芍、當歸、白芷組成。藥材來源于甘肅中醫藥大學炮制實驗室，經甘肅中醫藥大學中藥炮制室劉峰林博士鑒定，質量符合《中國藥典》要求。分別加2，4倍量水浸泡 2 h，煎煮 20，30 min，過濾合并濾液，濃縮至規定質量分數，冷藏，備用。金剛藤膠囊，湖北福人藥業股份有限公司產品，批號20150851；水合氯醛，中國白鶴化工廠產品，批號980101。TNF-α、IL-10、IgA、IgG酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，上海易莎生物科技有限公司產品，批號E20160301A。 電子計價秤，廣東香山有限公司產品；80-1型離心機(4 000轉/min)，上海云樓醫用儀器廠產品；BCD-290W冰箱，青島海爾股份有限公司產品；Tecan Infinite M200 PRO多功能酶標儀，Tecan集團奧地利有限公司；HHS-2S型恒溫水浴鍋，上海江儀儀器有限公司；10～1 000 μL Thermo4640060型移液槍, 賽默飛世爾科技(芬蘭)有限公司；LG-R-80A型全自動血液黏度儀，北京中勤世帝科學儀器有限公司產品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將60只雌性大鼠按體質量隨機分為假手術組，模型對照組，清熱祛瘀方高(21.0 g/kg)、中(10.5 g/kg)、低(5.3 g/kg)劑量組及金剛藤膠囊組(0.63 g/kg)6 組，每組10只，適應性飼養1周。按照文獻[2-3]方法建立慢性盆腔炎動物模型，方法如下：將大鼠用 100 g/L 水合氯醛麻醉，仰臥固定，下腹部手術部位去毛，常規消毒；沿腹中線于尿道口上方 1 cm 處向上切口 0.8～1.0 cm，暴露右側子宮，距卵巢 2 cm 處用5號針頭小心進針劃傷子宮，相同力量機械劃傷同側子宮5次后，分別向右側輸卵管-卵巢方向向卵巢方向緩慢注入 250 g/L苯酚膠漿溶液 0.05 mL，分層關腹。假手術組只切開腹部，暴露子宮后直接進行關腹處理。術后常規飼養7 d。造模成功后第8天開始，依據人與大鼠用藥量換算方法[4]計算用藥量，金剛藤組灌胃給予0.63 g/kg金剛藤，清熱祛瘀方高、中、低劑量組依次灌胃給予21.0，10.5 ，5.3 g/kg 清熱祛瘀方，模型對照組及假手術組蒸餾水給予10 μL/g 灌胃，1 d 1 次，共4周。

1.4 檢測指標

1.4.1 血流動力學

末次給藥24 h后，將禁食、不禁水16 h的動物用 100 g/L 的水合氯醛 350 μg/g腹腔麻醉，剖腹，股動脈采血 6 mL，置于含有125單位肝素抗凝管中。取肝素抗凝的全血 0.8 mL于全自動血液流變儀上測定全血黏度的高切、中切、低切值，紅細胞比容。將剩余的全血離心(2 500 r/min 離心10 min，分離血清及血漿，-20 ℃保存備用)，取 0.8 mL 血漿于全自動血液流變儀上測定血漿黏度。

1.4.2 血清IL-10、TNF-α、IgA、 IgG含量

取-20 ℃保存備用的血清按照參考文獻[5]，采用ELISA試劑盒法檢測大鼠血清IL-10、TNF-α、IgA和IgG，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 大鼠子宮腫脹度、腫脹抑制率

采血后處死大鼠，摘取雙側子宮及輸卵管，除去脂肪組織，稱量質量，放入100 mL /L的甲醛固定液中保存[6]。子宮腫脹度(g)= 右側子宮質量-左側子宮質量。腫脹抑制率(%)=(模型對照組腫脹度-給藥組腫脹度)÷模型對照組腫脹度×100%。

1.4.4 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠血流動力學指標對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠的血漿黏度，全血高切、中切、低切值和紅細胞比容均增高，差別有統計學意義(P<0.05),說明模型大鼠血液處于血瘀狀態。與模型對照組對比，清熱祛瘀方各劑量組和金剛藤組大鼠血漿黏度，全血高、中、低切黏度，紅細胞比容均不同程度降低，差別有統計學意義(P<0.05)。清熱祛瘀方高劑量組上述5個指標較金剛藤組差別有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 清熱祛瘀方對盆腔炎大鼠血流動力學的影響

注：與模型對照組對比，*P<0.05；與金剛藤組對比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠血清IL-10、TNF-α含量對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠血清IL-10下降，TNF-α升高，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，清熱祛瘀方各劑量組IL-10明顯升高，TNF-α下降，差別有統計學意義(P<0.05)。清熱祛瘀方各劑量組的IL-10、TNF-a較金剛藤組差別無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-10、TNF-α含量對比

注：與模型對照組對比，*P<0.05。

2.3 各組大鼠血清IgA、IgG 含量對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠血清IgA、IgG降低，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，清熱祛瘀方各劑量組血清IgA、IgG含量均有不同程度的升高，其中，高劑量組較之差別有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清IgA、IgG 含量對比

注：與模型對照組對比,*P<0.05。

2.4 各組大鼠大鼠子宮腫脹程度、腫脹抑制率對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠右側子宮質量和子宮腫脹度增加，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，清熱祛瘀方各劑量組右側子宮質量和子宮腫脹度減輕，差別有統計學意義(P<0.05)。清熱祛瘀方各劑量組的右側子宮質量和子宮腫脹度較金剛藤組差別有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠子宮腫脹程度、腫脹抑制率對比

注：與模型對照組對比,*P<0.05；與金剛藤組對比,#P< 0.05

3 討 論

慢性盆腔炎常為急性盆腔炎未能徹底治療，或患者體質弱，病情頑固，反復不愈，遷延所致[7],屬中醫學“婦人腹痛”“癥瘕”“不孕”等病證范疇，以濕熱瘀結證型最為多見。患者的舌質多紅、有瘀點瘀斑，舌苔多黃膩，脈象弦、滑，反映體內“濕”“熱”“瘀”的存在[8]，因此治療該病多用清熱利濕、活血化瘀之法。《素問·太陰陽明論》曰：“傷于濕者，下先受之。”濕性下趨，故多侵陰位，流注下焦，濕邪內郁，日久化熱，濕熱內蘊，阻滯沖任氣血，致氣滯血瘀、胞脈氣血運行不暢而發病。故該病標象為濕熱，血瘀貫穿始終，清熱利濕、祛瘀通絡為治療大法。方中紅藤、土茯苓、野菊花清熱解毒、活血散瘀通絡，配以黃柏增強清熱之效。當歸、丹參、赤芍、乳香、沒藥、五靈脂合奏行氣活血、消腫止痛之效，與白芷相佐，通滯散結。延胡索辛散溫通，即能入血分，又能入氣分，能治一身諸痛。赤芍輔助丹參活血化瘀、調經止痛，取其活血祛瘀之功并寓清熱涼血之意，以防瘀久化熱；同時，赤芍具有較強的抗炎作用，能抑制炎癥細胞浸潤，恢復黏膜上皮細胞功能，增強細胞分泌活動，促進炎癥介質前列腺素的降解。現代藥理研究[9]表明：丹參有促纖溶作用，可使纖維蛋白溶解，起到緩解組織粘連的作用，并且對血小板聚集有一定的抑制作用，從而達到抗凝血作用；當歸可降低血小板聚集，促進非特異性免疫功能，有增強單核巨噬細胞吞噬功能的作用，且其揮發油有抗炎、抗過敏及抗菌的作用。諸藥合用，共奏清熱利濕、活血化瘀、理氣止痛之效。

盆腔血液循環障礙被認為是慢性盆腔炎久治不愈、反復發作的原因之一。血流動力學指標反映血瘀的程度。臨床研究已證實：大部分 CPID 患者存在不同程度的血流動力學異常，即血液常處于黏、濃、凝、聚的狀態[10]。本研究中，清熱祛瘀方治療組血漿黏度和全血低切/高切黏度均顯著低于模型對照組，且不同程度改善了子宮及輸卵管的腫脹程度，這可能與本方運用大量活血化瘀藥的同時配伍少量清熱藥有關，改善了組織局部血流動力學，提高了臨床療效，彰顯了中醫藥多靶點治療疾病的特色。

西醫學研究發現：部分慢性盆腔炎在慢性發展過程中已無病原體的存在，慢性階段的病理改變是繼細菌感染后引起組織充血、水腫、毛細血管通透性增強，炎性物質滲出，造成局部組織粘連、功能損傷，刺激機體所發生的免疫反應所致，與細胞因子、炎癥介質等因素的異常改變有關。IL-10主要由Th2細胞產生，可抑制促炎癥細胞因子的產生與釋放，抑制炎性細胞因子引起的過強免疫反應，從而降低自身免疫應答，促進組織的修復和重建。TNF-α是影響機體炎癥進程的主要炎性因子之一，是一種由活化單核巨噬細胞、肥大細胞及活化的T淋巴細胞等多種炎癥細胞產生的具有廣泛生物活性的炎性前細胞因子，參與炎癥反應，在炎癥反應中起核心作用，是啟動炎癥的重要細胞因子。據文獻[11]報道：慢性盆腔炎模型大鼠血清IL-10水平顯著降低，大鼠血清TNF-α水平顯著升高。本研究中模型對照組大鼠血清IL-10水平較假手術組降低、大鼠血清TNF-α水平升高(P<0.05)，與文獻報道一致，提示機體促炎因子分泌和釋放亢進、抗炎因子分泌和釋放減少，使機體促炎與抑炎因子失衡，炎癥在體內不斷蔓延發展，組織損傷進一步加重。經清熱祛瘀方治療后，大鼠血清IL-10水平明顯升高(P<0.05)，大鼠血清TNF-α水平顯著下降(P<0.05)，提示清熱祛瘀方治療盆腔炎的機制可能是通過提高細胞免疫反應，降低外周血單核細胞和巨噬細胞分泌的TNF-α對單核細胞、淋巴細胞的趨化作用而減輕炎細胞對組織的浸潤來實現的。

免疫球蛋白是體液免疫的主要組成部分。免疫球蛋白IgA、IgG、IgM 是一類存在于人體血液或體液中有抗體活性的蛋白質，具有抗菌、抗病毒作用，并能在補體協同作用下殺死或溶解病原微生物，是機體抗感染免疫中的重要防御機制。本研究結果顯示:清熱祛瘀方能不同程度地促進了IgA、IgG的產生。表明：清熱祛瘀方能調節體液免疫，抑制機體變態反應(濕邪形成)的不斷發生，發揮抗炎、抗感染(熱邪)作用，從而有利于炎癥(濕熱)的減輕。

綜合上述，清熱祛瘀方可通過改善血流動力學來改善機體局部組織粘連及水腫狀態；提高抗炎細胞因子含量，抑制炎癥的發展促進組織再生和修復；增強機體的的免疫功能，從而達到“正氣內存，邪不可干”的目的。這可能是清熱祛瘀方治療CPID的機制之一。

[1]孫晶,陳瑩.婦炎寧湯對慢性盆腔炎模型大鼠體內炎癥細胞因子及粘連相關指標的影響[J].中華中醫藥學刊,2015,33(7):1729-1732.

[2]段娟娟.紅元顆粒治療慢性盆腔炎的藥效學研究[D].北京：北京中醫藥大學,2014.

[3]黃國鈞,黃勤挽.醫藥實驗動物模型制作與應用[M].北京：化學工業出版社，2008:582.

[4]潘艷,陳衛東.尾加壓素Ⅱ與糖尿病腎病大鼠動脈粥樣硬化形成的相關性研究及川穹嗪的干預作用[J].中國中西醫結合腎病雜志,2013,14(6):498.

[5]李迎曉.盆腔炎顆粒治療慢性盆腔炎療效觀察及對模型大鼠炎癥因子IL-6、IL-4影響的研究[D].濟南：山東中醫藥大學, 2011.

[6]宗惠.活血補腎法調控慢性盆腔炎大鼠炎癥細胞因子及粘連相關指標的實驗研究[D].濟南：山東中醫藥大學, 2010.

[7]吳豐儒.解毒化瘀類方劑治療慢性盆腔炎療效的系統評價與Meta分析[D].廣州：廣州中醫藥大學, 2013.

[8]于源源.盆腔炎顆粒治療慢性盆腔炎療效觀察及對模型大鼠炎癥細胞因子的影響[D].濟南：山東中醫藥大學, 2009.

[9]陳瑤.丹參調節AQP1效應與其改善微循環障礙(水瘀)的關系研究[D].西安：第四軍醫大學,2017.

[10]王艷萍,徐莉,張紅.慢性盆腔炎血瘀證的血液流變學研究[J].中國社區醫師,2005,7(9):76-77.

[11]李鑫,郭建生,師振予,等.婦科千金片對慢性盆腔炎大鼠血清炎性細胞因子表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013,19(10):228.

1001-6910(2017)09-0064-05

R711.33

:B

王新斌(1970-),男(漢族),甘肅蘭州人，博士研究生,副教授,副主任醫師,主要從事中醫婦科教學、臨床和科研工作。

2017-06-22；

2017-08-03

(編輯 陶 珠)

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.09.27

甘肅中醫藥大學中青年基金(BH2012-033)