黃芪多糖對結腸炎小鼠結腸黏膜IL-12 p40、IL-12 p70、IL-15和IL-21表達的影響*

劉 億, 趙海梅, 岳海洋,劉雪珂, 劉端勇,黃小英,鹿秀云

(1.江西中醫藥大學研究生院，江西 南昌 330004； 2.江西中醫藥大學基礎醫學院，江西 南昌 330004； 3.江西中醫藥大學科技學院，江西 南昌 330004； 4.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

·實驗研究·

黃芪多糖對結腸炎小鼠結腸黏膜IL-12 p40、IL-12 p70、IL-15和IL-21表達的影響*

劉 億1, 趙海梅2, 岳海洋1,劉雪珂1, 劉端勇3,黃小英4,鹿秀云3

(1.江西中醫藥大學研究生院，江西 南昌 330004； 2.江西中醫藥大學基礎醫學院，江西 南昌 330004； 3.江西中醫藥大學科技學院，江西 南昌 330004； 4.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

目的：探討黃芪多糖對潰瘍性結腸炎小鼠結腸黏膜白介素(interleukin, IL)-12p40 (IL-12p40)、IL-12p70、IL-21和IL-15表達的影響。方法：將40只C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、黃芪多糖組和美沙拉嗪組4組，每組10只。采用三硝基苯磺酸/乙醇法復制結腸炎小鼠模型。黃芪多糖組予以200 μg/g APS混懸液灌胃，美沙拉嗪組給予150 μg/g美沙拉嗪混懸液灌胃，正常對照組及模型對照組給予等容積的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續給藥7 d。第8天，處死小鼠，分離結腸。采用酶聯免疫吸附法檢測結腸組織勻漿中IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15的表達水平。結果:與正常對照組對比，模型對照組小鼠結腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-15和IL-21表達水平均升高，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，黃芪多糖組小鼠結腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-15和IL-21表達水平均下降，差別有統計學意義(P<0.01)。結論:黃芪多糖可有效抑制結腸炎小鼠結腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-15和IL-21的表達。

結腸炎；黃芪多糖/藥效學； IL-12； IL-21； IL-15；動物；小鼠

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是被WHO認定的世界性難治病之一，是以結腸黏膜及黏膜下層炎癥為特征的慢性腸道疾患。UC的發病機制并不清楚，免疫狀態紊亂在其發病過程中發揮著重要作用，這些免疫性因素主要包括炎性介質、細胞因子及免疫調節等，其中以白介素(interleukin, IL)為主體的細胞因子失衡起了關鍵性作用。IL-12、IL-15和IL-21等在調節免疫細胞活性并相互作用扮演了重要角色[1-2]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黃芪的主要活性成分之一,可作為免疫促進劑和調節劑，可有效治療實驗性小鼠UC[3-4]。本實驗通過測定APS對UC小鼠結腸黏膜中IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15表達的影響探究其治療實驗性小鼠UC可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

清潔級健康 C57BL/6小鼠40只，雄性，體質量(20 ± 2) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK(京)2007- 0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

APS，純度 98%，陜西森弗生物技術有限公司產品，批號HQ090312；美沙拉嗪，佳木斯鹿靈制藥有限公司產品，批號130407；TNBS，Sigma公司產品，批號 2508- 19。IL-12 p40 ELISA試劑盒，Pierce公司產品，批號EMIL12P40；IL-12 p70 ELISA試劑盒(批號BMS6004)、IL-21 ELISA試劑盒(批號BMS6021)、IL-15 ELISA試劑盒(批號BMS6023)，均為eBioscience公司產品。5424R型低溫高速離心機，德國Eppendorf公司產品；MR-96T型Anthos 2010型酶標儀，上海博賽斯科技有限公司產品。

1.3 動物分組

將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、黃芪多糖組和美沙拉嗪組4組，每組10只，適應性飼養3 d。

1.4 模型的建立

參照文獻[5]，采用三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS) /乙醇法復制UC小鼠模型。造模前禁食12 h，除正常對照組外，其余小鼠以10 g/L戊巴比妥鈉溶液(5 μL/g)肌肉注射麻醉；將100 μg/g體質量TNBS溶入0.15 mL體積分數為500 mL/L的乙醇溶液中，配制成TNBS/乙醇復合溶液；用塑料軟管(直徑約1 mm )將TNBS/乙醇復合液注入小鼠腸管距肛門約4 cm處，倒置小鼠5 min，使藥液完全被送入結腸部位。小鼠自然蘇醒后，將其放入鼠籠，給予水和食料。

1.5 給藥方法

自TNBS灌腸后第2天開始，按體質量換算，黃芪多糖組予以200 μg/g APS混懸液灌胃，美沙拉嗪組給予150 μg/g美沙拉嗪混懸液灌胃，正常對照組及模型對照組給予等容積的生理鹽水灌胃。1 d 1次，連續給藥7 d。

1.6 檢測指標

第8天，頸椎脫臼處死小鼠，解剖并分離結腸，沿縱軸剖開，以PBS沖洗結腸內容物，取部分結腸，加適量10倍PBS制備組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清-80 ℃保存用于檢測。檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進行，并采用酶標儀于波長450 nm檢測各自吸光值，計算小鼠結腸組織勻漿中IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15水平。

1.7 統計學方法

2 結 果

與正常對照組對比，模型對照組小鼠結腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15表達水平升高，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，黃芪多糖組小鼠結腸黏膜IL-12p40、IL-12p70、IL-21和IL-15表達水平下降，差別有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠結腸黏膜IL-12 p40、IL-12 p70、IL-21和IL-15對比

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，，##P<0.01。

3 討 論

潰瘍性結腸炎是典型的腸道非特異性炎性疾病，以大量炎細胞浸潤和持續活化為主要特征。促炎因子和抑炎因子失衡在UC病理損傷過程扮演了重要角色，IL-12、IL-15和IL-21是比較突出的細胞因子。作為一種促炎因子，IL-12和IFN-γ相互作用，參與UC的發病與轉歸，主要有p40亞基和p35亞基，二者均通過二硫鍵互相連接形成p70，才具有相應的免疫調節和促炎等生物活性。IL-12活化后能促進樹突狀細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞活化，分化，產生細胞因子，并作為趨化因子趨化上述細胞至患病局部;同時產生過量的基質降解酶，從而破壞結腸黏膜的完整性，最終導致結腸黏膜的炎性損傷；而中和或降低IL-12表達則可明顯減輕UC[6-8]。IL-21和IL-15具有高度同源性，同屬于I型細胞因子超家族，由活化的Th2細胞、NK細胞、T細胞及(DC)樹突狀細胞分泌。IL-21與其受體結合，通過活化JAKs-STATs 信號通路，升高STAT3在結腸胞膜上的表達，在刺激T細胞等增殖分化(如分化成Th17細胞)的同時，促進IL-17分泌，或刺激NK細胞分泌TNF-α、IFN-γ，進而造成腸道炎性損傷；且基因多態性分析也表明IL-21和炎癥性腸病的發展相關[9-11]。大量的研究[12-13]證明：IL-15是一種具有多效性的重要促炎因子，在促進細胞毒性淋巴細胞(CTL)和NK細胞的增生和活化的同時，提升IFN-γ、TNF-α 表達水平，進而誘導炎癥反應；同時可通過活化JAKs-STATs 信號通路激活樹突狀細胞等免疫細胞，抑制Th2細胞增殖分化，造成免疫功能紊亂，從而介導免疫損傷。在本實驗中，UC模型小鼠結腸黏膜中IL-12、IL-15和IL-21的水平均明顯升高，提示：在TNBS誘導的結腸炎發生過程中，此3者表達水平升高是其發病的重要特征之一；IL-12P40不僅總量升高，還聚合成IL-12P70而產生促進免疫細胞活化及分泌細胞因子等生物活性。同時，IL-15和IL-21水平升高，可能通過JAK/STAT信號進一步誘導免疫細胞活化，導致免疫反應過度興奮，促炎因子大量產生，促發炎性免疫損傷的形成。本實驗中，黃芪多糖連續給藥7 d后，IL-12P40、IL-12P70、IL-15和IL-21的表達水平明顯被抑制，結合筆者前期實驗[14]發現，黃芪多糖有效治療TNBS誘導的結腸炎可能是通過調節Treg/Th17間平衡及其相關細胞因子水平實現的。因此得出：黃芪多糖有效治療TNBS誘導的結腸炎可能與其抑制IL-12 P40、IL-12 P70、IL-15和IL-21的表達相關，進而調控機體的免疫狀態，恢復免疫平衡。分析中筆者發現：這幾個細胞因子均與JAK/STAT信號直接或間接相關，但黃芪多糖能否通過抑制這些細胞因子表達調控JAK/STAT信號的活化程度不得而知，今后的工作可以以黃芪多糖能否調控JAK/STAT信號干預相關免疫細胞的活化水平從而治療UC為研究目標展開，此對于明確從調控免疫狀態的信號通路和作用靶點的角度揭示黃芪多糖治療UC的作用機制具有重要而現實的意義。

[1]王巖，楊立，劉威羽. 益生菌對活動期潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織及IFN-γ、IL-12表達的影響[J]. 貴陽醫學院學報, 2015,40 (11):1190-1193.

[2]夏興洲, 劉占舉. IL-21受體在潰瘍性結腸炎中的表達及對促炎癥細胞因子分泌的誘導作用[J]. 世界華人消化雜志, 2009,17 (1):102-105.

[3]岳輝.黃芪多糖藥理作用的研究進展[J].牡丹江醫學院學報, 2011, 32 (1):60-62.

[4]YANG M, LIN HB, GONG S, et al. Effect of Astragelus polysaccharides on expression of TNF-α, IL-1β and NFATc4 in a rat model of experimental colitis[J].Cytokine, 2014, 70(2):81-86.

[5]劉端勇，徐榮，黃敏芳，等.姜黃素對結腸炎小鼠脾臟樹突狀細胞表面共刺激分子表達的影響[J].中成藥，2016，38(9)：2039-2041.

[6]楊立, 肖明明, 李艷，等.雷公藤甲素對實驗性大鼠結腸炎組織中細胞 因子IFN-γ 、IL-12表達的影響[J].實用藥物與臨床, 2016,19(11):1332-1336.

[7]陳聰, 劉芳, 張聰，等.IL- 12p40、 IL-12p70 在經典型霍奇金淋巴瘤中的表達及意義[J].安徽醫科大學學報, 2015,50(9):1332-1336.

[8]楊立，李艷，任秋華，等.益生菌 VSL#3 對實驗性結腸炎大鼠結腸黏膜IFN-γ、IL-12 表達的影響[J].安徽醫科大學學報, 2014,23(4):406-410.

[9]TANGYE SG．Advances in IL-21 biology, enhancing our understanding of human disease[J]．Curtopin Immunol，2015，34：107-115.

[10]楊德娟.IL-21 及其受體在自身免疫性疾病中的作用[J].中國當代兒科雜志, 2016,18(5):466-471.

[11]李晨, 范堯夫, 劉皓,等.芍黃安腸湯治療活動期潰瘍性結腸炎療效及其對TNF-α、IL-17及IL-21水平的影響[J].世界華人消化雜志, 2013,21(32): 3580- 3584.

[12]羅信, 吳淑云, 王凌云.IL-15 與腫瘤治療的研究進展[J].中國免疫學雜志, 2016,32(6):911-916.

[13]趙煜,張濤, 譚勇,等.IL-15 對樹突狀細胞激活的 T 淋巴細胞免疫反應的作用觀察[J].中國腫瘤臨床, 2013,40(3):127-130.

[14]ZHAO HM, WANG Y, HUANG XY, et al.Astragalus polysaccharide attenuates rat experimental colitis by inducing regulatory T cells in intestinal Peyer’s patches[J].World J Gastroenterol，2016，22(11): 3175-3185.

1001-6910(2017)09-0058-03

R574.62

:B

2017-06-13；

2017-07-26

(編輯 陶 珠)

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.09.25

鹿秀云，講師、主治醫師，luxiuyun139@163.com

江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ151562)、江西省中醫藥科技計劃項目(2016B010)、國家自然科學基金項目(81460679)、江西省衛生廳中醫藥科研計劃(2012A017)