夏枯草提取物抑制大鼠腎草酸鈣結石形成作用的研究

何彥豐， 高 銳， 江 濤， 林 曦， 毛厚平

夏枯草提取物抑制大鼠腎草酸鈣結石形成作用的研究

何彥豐， 高 銳， 江 濤， 林 曦， 毛厚平

目的研究夏枯草提取物對大鼠腎草酸鈣結石的作用及機制。方法將40只雄性Wistar大鼠隨機分為4 組：對照組、模型組、夏枯草提取物低劑量(50 g/L)和高劑量(100 g/L)實驗組。實驗4周后處死動物，將各組大鼠腎臟標本制成組織切片，H-E染色，觀察大鼠腎組織病理學改變；檢測大鼠血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、磷(P)和Ca2+的含量，檢測24 h尿液中Ca2+和草酸(Ox)的含量；運用熒光定量PCR和Western-blot檢測大鼠腎內TRPV5 mRNA和蛋白的表達，并進行統計學分析。結果與對照組比較，模型組大鼠腎呈現草酸鈣結石病理改變，不同濃度的夏枯草提取物作用后，可明顯改善其病理變化。模型組血清BUN，Cr，Ca2+和P含量明顯升高，經不同濃度的夏枯草提取物作用后，實驗組BUN及Cr含量明顯低于模型組(P<0.05)，但實驗組和模型組Ca2+及P含量比較無顯著性差異；模型組尿液Ca2+，Ox含量較對照組明顯升高，經不同濃度的夏枯草提取物作用后，可降低實驗組Ca2+含量，且成藥物劑量依賴性(P<0.05)，但對Ox的含量無顯著性作用；模型組腎內TRPV5 mRNA和蛋白的表達明顯降低，經不同濃度的夏枯草水提取物作用后，實驗組TRPV5 mRNA和蛋白的表達逆轉，且具有統計學意義(P<0.05)。結論夏枯草對大鼠腎草酸鈣結石具有防治作用；可能是通過上調大鼠腎臟尿鈣調控信號TRPV5的表達，降低血清中BUN、Cr含量及尿液中Ca2+的含量。

夏枯草； 草酸鈣； 結石，腎； 香草酸； 電位測定法

夏枯草(PrunellaVulgarisL)為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗，具有降壓、降糖、抗炎和免疫調節等藥理作用。近年來，夏枯草對草酸鈣結石的防治作用得到了深入的研究。Utsunomiya等在體外實驗發現，夏枯草水提取物能有效抑制草酸鈣結晶的成核、生長和聚集，降低了草酸鹽的飽和度，從而顯著抑制草酸鈣結石的形成，但其具體的理論基礎及機制仍不清楚[1]。瞬時性受體電位通道香草酸受體(transient receptor potential vanilloid receptor，TRPV) 蛋白是一類編碼陽離子通道的蛋白家族，共有6個成員：TRPVl～TRPV6，其中TRPV5是尿鈣重吸收的重要調控分子，是調控腎小管鈣離子跨細胞膜轉運的新型鈣離子通道[2]。筆者擬通過建立大鼠腎草酸鈣結石模型研究不同濃度夏枯草提取物對腎草酸鈣結石模型大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、磷(P)和Ca2+含量，以及24 h尿液中Ca2+和草酸(Ox)含量的影響，同時評價大鼠腎內TRPV5 mRNA和蛋白的表達水平，探討夏枯草提取物對腎草酸鈣結石的防治作用以及是否通過TRPV5信號通路抑制腎草酸鈣結石形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠40只，體質量(225±25)g，由福建醫科大學實驗動物中心提供(許可證號:SCXK2012-0003)。大鼠常規飼料喂養，正常飲水，飼養房溫度為(20±3)℃，濕度為35%～55%，光照10 h/d。

1.2 試劑和儀器 試劑：夏枯草全草(批號：20141005，西安天瑞生物技術有限公司)；兔抗大鼠TRPV5抗體(批號：PB0549)、羊抗兔二抗(批號：BA1003)、β-actin兔多克隆抗體(批號：BA2305)均由武漢博士德生物技術有限公司提供；RNA抽提試劑盒(批號：AM1926)、cDNA逆轉錄試劑盒(批號：K1631)及聚合酶鏈反應(PCR)反應試劑盒(批號：B55)均由加拿大Fermentas公司提供。

儀器：超低溫冰箱(U85-13型，美國Thermo公司)；自動生化分析儀(Aul000型，日本Olympus公司)；核酸蛋白分析儀(德國Beckman公司)；穩壓垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)；PCR儀(美國PTC公司)。

1.3 方法

1.3.1 夏枯草提取物的制備 50 g夏枯草加蒸餾水500 mL，煮沸30 min后過濾除渣，并濃縮成質量濃度為1 g/mL的濃縮液。按藥物質量濃度分別配制為低劑量50 g/L和高劑量100 g/L(以生藥量計)。

1.3.2 分組 40只大鼠采用系統隨機化法隨機均分為4組。對照組：大鼠飲用自來水；模型組(草酸鈣腎結石模型組)：大鼠采用1%乙二醇和2%氯化銨3.0 mL每天分2次灌胃；實驗組：在草酸鈣腎結石模型制作的同時給予藥物干預，采用50 g/L(低劑量)或100 g/L(高劑量)夏枯草水提取物1.0 g/d灌胃，每天1次。各組動物飼養4周后處死，取出腎臟，將腎臟標本修剪為1～1.5 cm3組織塊，一部分以10%甲醛溶液固定、石蠟包埋，制成厚度為4 μm的腎臟組織切片；一部分采用液氮速冷保存，用于實時熒光定量PCR及Western-blot的檢測。

1.3.3 尿液和血液生化指標檢測 各組動物于實驗結束前1天用代謝籠收集24 h尿量，測24 h尿液Ox含量、尿液總Mg2+和Ca2+的含量；于下腔靜脈穿刺取血，檢測血清Ca2+，P，BUN和Cr含量。

1.3.4 腎臟組織學指標 將腎臟組織切片進行H-E染色，光學顯微鏡觀察各組大鼠腎臟組織的改變。根據以下標準判定大鼠腎臟草酸鈣結石嚴重程度：腎皮質、髓質及腎乳頭形態結構正常，未見顯著的結晶沉淀物及腎結石計0分；腎臟皮質及髓質內可見散在的、少量的結晶沉淀計1分；腎皮質以及髓質內可見明顯的游離結晶以及結晶沉淀物計2分；腎乳頭部位可見鈣化斑、腎皮質及髓質內可見較多結晶計3分；腎乳頭部位可見鈣化斑、腎皮質及髓質內可見大量結晶并伴有游離結石形成計4分[3]。

1.3.5 Western-blot測定 將取得的腎臟組織塊采用勻漿器制成勻漿后，以磷酸緩沖液(PBS)洗滌2～3次，加入組織裂解液進行裂解，加入蛋白抽提液抽提總蛋白。紫外分光光度計測定蛋白濃度：取蛋白20～100 μg，經10%SDS-PAGE電泳分離、轉膜和封閉后，加入TRPV5(1∶1 000)和β-actin(1∶500)抗體4 ℃孵育過夜，1∶5 000稀釋的HRP標記的二抗室溫孵育1.5 h，暗室曝光，X線膠片顯影、定影、曝光。目的條帶以β-actin平均光密度值進行內標準校正，用Image-Pro Plus 6.0軟件對蛋白相對表達水平進行分析。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測 以GAPDH作為內參，人工合成GAPDH標準模板，稀釋成不同濃度，分別取樣2 μL加入30 μL的反應體系中，進行PCR反應。以標準模板Ct為縱坐標，以標準品各稀釋度的起始靶DNA拷貝數的對數作為橫坐標，制作標準曲線。用RNA提取試劑盒提取各組腎組織中的RNA，確定樣本的純度和濃度，按照cDNA合成試劑盒的要求，將RNA反轉錄成cDNA。取反轉錄產物1 μL進行熒光定量PCR擴增，PCR擴增體系：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2 μL引物(上、下游各1 μL，終濃度200 nmol/L、1 μL cDNA。擴增條件：95 ℃ 5 min→95 ℃ 10 s→60 ℃ 35 s，40個循環。得到樣本的Ct值，依據標準曲線所得公式，得出每組樣本的基因相對拷貝數(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物和探針

2 結 果

2.1 夏枯草提取物對大鼠腎臟組織學的影響 對照組大鼠腎小管未見擴張和任何草酸鈣晶體沉積；模型組大部分鼠腎組織腫脹，表面可見點狀分布結晶或鈣化，H-E染色可見草酸鈣結晶為無色透明晶體，腎小管管腔明顯擴張，多數管腔內存在片狀結晶，鏡下見結晶體主要位于近曲小管和遠曲小管，上皮細胞明顯腫脹，腎間質有明顯慢性炎性細胞浸潤；不同濃度夏枯草提取物作用后，腎小管腔僅可見較少散在草酸鈣結晶存在，管腔擴張程度較草酸鈣結石組輕(圖1)。組織學評分結果顯示，與對照組評分(1.08±0.22)比較，模型組為(3.56±0.95)，差別有統計學意義(P<0.05)；低、高劑量實驗組評分分別為(2.63±0.67)和(2.08±0.34)，與模型組比較差別具有統計學意義(P<0.05)。

A:對照組.大鼠腎小管未見擴張和任何草酸鈣晶體沉積; B:模型組.結晶體主要位于近曲小管和遠曲小管,上皮細胞明顯腫脹,腎間質有明顯慢性炎性細胞浸潤; C,D:低、高劑量實驗組.腎小管腔可見較少散在草酸鈣結晶存在,管腔擴張程度較模型組組輕(箭頭所指為草酸鈣結晶).圖1 各組大鼠腎臟組織切片(H-E ×400) Fig 1 Histopathological manifestation in mice of different groups(H-E ×400)

2.2 夏枯草提取物對大鼠血清生化指標的影響 與對照組比較，模型組血清BUN,Cr,Ca2+和P含量明顯升高；經不同濃度的夏枯草提取物作用后，血清BUN，Cr明顯降低(P<0.05)，但Ca2+,P含量變化無顯著性差異(表1)。

表1 各組實驗大鼠血清生化指標的比較

n=10. BUN：尿毒氮； Cr：肌酐. 與對照組比較,☆:P<0.05;與模型組比較,△:P<0.05.

2.3 夏枯草提取物對大鼠尿Ox，Ca2+，Mg2+的影響 與對照組比較，模型組尿液Ca2+及Ox含量明顯升高；經不同濃度的夏枯草提取物作用后，可降低Ca2+濃度濃度，且成藥物劑量依賴性(P<0.05)，但對Ox含量影響無顯著性差異；各組大鼠尿液Mg2+濃度無明顯差異(表2)。

表2 各組大鼠24 h尿液中Ca2+ ，Mg2+和Ox含量比較

n=10. Ox:草酸. 與對照組比較,☆:P<0.01;與模型組比較,△:P<0.05.

2.4 夏枯草水提取物對大鼠TRPV5 mRNA及蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組TRPV5 mRNA及蛋白表達水平明顯降低；經不同濃度的夏枯草提取物作用后，TRPV5 mRNA及蛋白表達明顯升高，且具有統計學意義(P<0.05，圖2)。

n=10. 與對照組比較,☆:P<0.05;與模型組比較,△:P<0.05.圖2 夏枯草水提取物對不同實驗組大鼠TRPV5 mRNA及蛋白的影響Fig 2 The effect of prunella vulgaris on TRPV5 mRNA and protein of different groups

3 討 論

腎結石屬祖國醫學“砂淋”“石淋”和“血淋”范疇，是泌尿外科的常見病和多發病，其中70%～80%為草酸鈣結石。草酸鈣結石發病機制尚不清楚，治療后容易復發，目前尚不能對其進行有效地防治。中藥材用于防治尿石癥已有數千年歷史，研究者一直試圖在中藥材中尋找預防和治療草酸鈣結石的藥物和方劑[4]。夏枯草為唇形利夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗，其味苦、性寒、辛，有降壓、利尿、清熱散結和抗腫瘤等功效，已經明確夏枯草的化學成分有三萜類化合物、甾體類化合物、黃酮類、香豆素類、有機酸和苯丙素類等[5]。Koide等研究也發現，夏枯草能有效抑制尿草酸鈣結晶的生長和聚集，有顯著抑制草酸鈣結石形成的作用[6]。尹春萍等研究也發現，夏枯草水提取液在體外明顯抑制尿草酸鈣結晶的生長和自發性結晶的形成，隨著人工尿液的離子強度降低和pH值升高時，其抑制活性逐漸增強[7]。研究認為，低離子強度和高pH可增強夏枯草吸附于草酸鈣晶體表面的能力，不利于草酸鈣結晶的形成。越來越多的研究證實，夏枯草水提取物在體外能夠促進草酸鈣結晶成核和微結晶作用，降低草酸鹽的飽和度，從而顯著抑制草酸鈣晶體的聚集和生長，減少草酸鈣結石的形成,但是夏枯草提取物防治結石的理論基礎及具體機制仍不清楚[8]。

物理化學研究表明，尿液中的草酸鈣飽和度與尿鈣的濃度有關，尿鈣增高易于誘發或促進草酸鈣結石的形成。腎小管對鈣的主動重吸收對尿鈣水平影響較大，是控制尿鈣水平的主要因素[9]。TRPV5是新近發現的調控Ca2+跨膜轉運的重要蛋白質分子，是位于細胞膜上的一種高度選擇性的受體活化性離子通道，具有高度鈣離子選擇性，其中以腎遠曲小管和集合小管表達最強。TRPV5在機體內常與鈣結合蛋白、Na+/Ca2+交換蛋白等其他鈣主動重吸收蛋白共存在、共表達，介導鈣離子跨細胞膜轉運的通道，控制鈣離子的跨膜流動，維持體內鈣離子的平衡[10]。王少剛等研究發現，在遺傳性高鈣尿結石大鼠腎組織中，TRPV5是尿鈣重吸收重要的調控分子，其表達水平下降可能是特發性高鈣尿癥及尿石形成的重要發病機制[11]。Hoenderop等對TRPV5 基因敲除的小鼠研究發現，TRPV5蛋白失活小鼠的尿鈣排泄量比正常對照組高出6倍。表明TRPV5缺乏導致鈣的重吸收障礙，繼而產生了高尿鈣和鈣排泄量的增加[12]。由此可見，TRPV5是腎對尿鈣主動重吸收的關鍵限速點，也是尿鈣水平的主要調控點，其在維持尿鈣水平中發揮了重要作用。

本研究通過草酸鈣大鼠模型從大鼠體內研究夏枯草提取物對大鼠尿鈣調控通路的影響，結果顯示，對照組大鼠血清BUN、Cr均低于其他實驗組，血清Ca2+，P的含量各組之間差別無統計學意義；夏枯草提取液低劑量組及高劑量組血清BUN，Cr水平與模型組比較雖然差別無統計學意義，但是有降低趨勢，表明乙二醇-氯化銨法誘導草酸鈣結石模型大鼠的腎功能有一定損害，而夏枯草水提取液對大鼠腎功能無明顯的影響，而且可以起到一定程度的保護腎功能作用。夏枯草水提取液不能降低血清Ca2+的濃度，與模型組比較夏枯草提取物可降低尿液Ca2+濃度，且成藥物劑量依賴性，但是并不能降低尿液草酸的濃度。表明夏枯草水提取液對草酸的代謝無顯著性影響，其抑制草酸鈣結石的形成可能是降低了尿液中Ca2+的濃度，從而抑制了草酸鈣的飽和度。采用熒光定量PCR和Western-blot檢測表明，夏枯草水提取物能明顯上調大鼠腎組織TRPV5 mRNA和蛋白表達水平，并且呈藥物劑量依賴性。提示夏枯草可能上調大鼠腎組織TRPV5的表達，增加腎小管對尿Ca2+的主動重吸收，減少尿Ca2+的排出，降低了尿液中草酸鹽的飽和度，起到抑制草酸鈣結石形成的作用。

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(編輯:常志衛)

The Effect and Its Mechanism ofPrunellaVulgarison Inhibiting Renal Calcium Oxalate Stone Formation

HE Yanfeng, GAO Rui, JIANG Tao, LIN Xi, MAO Houping

The Second Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou350005，China

Objective To study the effect of prunella vulgaris on calcium ion channel TRPV5 in rat, and investigate its mechanism on calcium oxalate nephrolithiasis. Methods The Wistar rats were randomly divided into four groups(n=10 each): A group (normal control), B group (stone formation model), C group (treated by 50 g/L methanolic extract from prunella vulgaris), D group(treated by 100 g/L methanolic extract from prunella vulgaris). The model rats with renal calcium oxalate stone formation were induced by intragastric administration of ethylene glycol and ammonium chloride. After 4 weeks, the concentration of serum creatinine(Cr), blood urea nitrogen(BUN), Ca2+, P, 24 h urinary excretion Ca2+, Mg2+, and oxalate were detected. Renal samples were collected to prepare tissue slices and observe the pathological changes. The expression of TRPV5 was detected by Western blotting and real-time PCR. Results Compared with control group, nephrolithiasis rats in B group (model group) showed significant pathological changes in calcium oxalate calculus. After prunella vulgaris treatments, the renal pathological changes were shown. The concentration of Cr, BUN and urine calcium in group C and D were lower than those in group B(P<0.05) , There was no difference in serum Ca2+，P, urine Mg2+, and oxalate between group C, D and group B(P>0.05). The expressions of TRPV5 protein and mRNA in group C and D were higher than those in group B(P<0.05). Conclusion The results showed that prunella vulgaris may increase the expression of TRPV5 in rats, while decrease the urine Ca2+, and reduce calcium oxalate saturation. It can inhibit renal calcium oxalate stone formation.

prunella asiatica;calcium oxalate；calculi, kidney；vanillic acid;potentiometry

2016-12-23

福建省衛生廳中醫藥科研課題(WZSY201310)

福建醫科大學 附屬第一醫院泌尿外科二區， 福州 350005

何彥豐，男，住院醫師

高 銳.Email：fyyyruigao@163.com

R-332； R282.71； R322.61； R348.1； R692.4

: A

: 1672-4194(2017)04-0223-05