樹突狀細胞聯合細胞因子誘導殺傷細胞治療術后惡性黑色素瘤的療效分析

劉施佳， 謝云青， 龔福生， 陳路川， 魏晟宏， 應敏剛， 鄭秋紅

樹突狀細胞聯合細胞因子誘導殺傷細胞治療術后惡性黑色素瘤的療效分析

劉施佳， 謝云青， 龔福生， 陳路川， 魏晟宏， 應敏剛， 鄭秋紅

目的探討樹突狀細胞聯合細胞因子誘導殺傷細胞(DC-CIK)在治療術后惡性黑色素瘤(MM)的療效以及安全性分析。方法收集經病理確診的MM患者77例，分為治療組37例和對照組40例。對照組進行單純手術治療，治療組于手術后進行DC-CIK治療。對2組患者進行生存隨訪，比較2組患者的生存期、免疫功能和生活質量改善情況，觀察不良反應，并進行預后相關因素的單因素和多因素分析。結果治療組和對照組的中位生存期分別為45和29月，治療組的總生存期顯著高于對照組(P=0.018)；2組的無進展生存期差別無統計學意義(P=0.245)。治療組患者的免疫功能和生活質量均得到顯著改善，僅2例發生不良反應,且未達3/4級。是否有淋巴結轉移(P=0.008)、是否進行DC-CIK治療(P=0.02)以及治療療程數(P=0.031)是影響MM預后的獨立預后因子。結論DC-CIK細胞免疫治療可延長MM患者的生存期，提高其免疫功能，改善其生活質量，治療過程安全性高，無明顯副作用；治療療程多于4次時，療效更好。

黑色素瘤； 樹突細胞； 細胞因子類； 殺傷細胞

惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是一種來源于黑色素細胞的腫瘤，惡性度高，主要見于皮膚，發病率約占所有惡性腫瘤的1%～3%[1]。我國的MM發病率雖低于歐美國家，但近年有明顯增長的趨勢，年增長率為3%～5%，每年約有20 000新增病例[2]。MM早期(Ⅰ及Ⅱ期)或局部病變，手術切除可治愈，一旦發展至晚期(Ⅲ及Ⅳ期)且發生遠處轉移,則很難治愈，其中位生存期僅8～9月，3年生存率僅10%～15%，5年生存率不足10%[3-4]。臨床上發現，MM細胞對放療和化療均不敏感，這也是MM致死率高、預后差的主要原因。多項研究表明，MM細胞具有較強的免疫原性，對免疫治療較為敏感，尤其是國內外關于PD-1及PD-L1的研究成果及臨床試驗已充分證明，免疫治療是提高MM治療療效最有希望的方式[5-7]。

隨著腫瘤免疫學及細胞生物學等學科的發展，樹突狀細胞(dendritic cells, DC)與細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer, CIK)聯合介導的過繼免疫細胞治療可清除循環腫瘤細胞及微小轉移灶，降低腫瘤的轉移復發率，延長患者的生存時間，并提高其生活質量，同時具有安全性高、無明顯毒副反應等特點[8]，正逐漸成為繼手術、放療和化療后的第4種重要輔助療法。2004年5月-2013年5月，筆者醫院收治的手術聯合DC-CIK細胞免疫治療的MM患者共37例，現回顧性分析其臨床資料，并探討手術聯合DC-CIK細胞免疫治療MM的有效性及安全性，報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 MM患者37例(治療組)，男性25例，女性12例，年齡中位數57歲(48～74歲)；黏膜MM 14例，皮膚MM 23例；區域淋巴結轉移17例，遠處轉移7例；37例均于術后接受DC-CIK細胞回輸治療。對照組為同期收治的單純行手術治療的MM患者40例，男性27例，女性13例，年齡中位數56歲(46～73歲)；黏膜MM 15例，皮膚MM 25例；區域淋巴結轉移19例，遠處轉移6例。2組嚴格按照病情、年齡進行1∶1匹配，不同病情的患者所占比例差別無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核同意，患者或家屬均知情并簽署同意書。

納入標準：(1)經病理組織學或細胞學確診；(2)Kamofsky評分≥70分；(3)預計能完成DC-CIK治療2個療程以上或生存期至少>8周，未接受其他抗腫瘤方法治療；(4)心、肝、腎等臟器功能無明顯異常。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 淋巴細胞分離液(Ficoll-PagueTMPremium，美國GE Healthcare公司)；抗人CD3單克隆抗體及GT-T551培養基(北京寶日醫生物技術有限公司)；γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factors α, TNF-α)(上海Novoprotein公司)；重組人白細胞介素2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)(北京四環生物制藥有限公司)；注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte/macrophage colonystimulating factor for injection,rhGM-CSF)及rhIL-4(廈門特寶生物工程有限公司)；流式細胞儀(FC500)及流式細胞術所用抗體CD45-PC7，CD3-FITC/CD(16+56)-PE，CD86-PE，CD83-PE，HLA-DR-ECD，CD80-FITC，CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5(美國Beckman公司)。

1.2.2 治療方法 治療組接受手術治療后15 d進行DC-CIK細胞回輸，連續4次為1個療程，共2～13個療程。對照組按照《中國黑色素瘤診療指南》規定的治療原則行手術治療。

1.2.3 DC-CIK細胞的制備 參照文獻[9]的方法，抽取患者新鮮外周全血100 mL，用肝素抗凝后，經淋巴分離液梯度離心，取單個核細胞，用RPMI 1640培養液懸浮細胞，離心洗滌細胞3次后，將細胞接種于培養瓶中，置37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱孵育120 min，貼壁細胞中加入含75 ng/mL的GM-CSF和50 ng/mL的rhIL-4的GT-T551培養基，每3天換液1次，第4天按40 μg/mL加入自體腫瘤組織凍融抗原，第5天加入50 ng/mL的TNF-α，第7天將抗原負載成熟后的DC，計數細胞，取部分細胞進行流式細胞表型分析，其他細胞用生理鹽水制備成1 mL的DC懸液(細胞數≥107)(DC+0.5%人血白蛋白)，給患者腹股溝淋巴結周圍區皮下注射。收集非貼壁細胞，移入經50 μg/mL的CD3單抗包被過的75 cm2培養瓶中，用GT-T551培養基調整細胞密度為1×106mL-1，加入1 000 U/mL的IFN-γ及rhIL-2，每3天補液1次(GT-T551培養基)，同時補加500 U/mL的rhIL-2。分別于培養的第10及12天收集CIK細胞，計數細胞，取部分細胞進行流式細胞表型分析，其他細胞置于200 mL含0.5%人血白蛋白的生理鹽水中，回輸給患者。針對每次回輸的DC及CIK細胞，回輸前對細胞培養液取樣進行細菌、真菌、支原體及內毒素檢測，均為陰性。每個療程CIK細胞數不低于1.0×1010。

1.2.4 DC-CIK細胞流式細胞儀表型檢測及患者外周血免疫功能評價 (1)DC細胞表型檢測：CD86+，HLA-DR+，CD80+，CD83+檢測DC成熟度。(2)CIK細胞表型檢測：CD3+CD4+，CD3+CD8+檢測T細胞亞群比例；CD3-CD(16+56)+檢測NK細胞比例；CD3+CD(16+56)+檢測NKT細胞比例。(3)患者外周血免疫功能評價：通過檢測外周血單核細胞的T淋巴細胞亞群來評價免疫功能，包括CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+和CD3-CD(16+56)+的變化，細胞回輸前及治療結束后10 d，用流式細胞儀檢測患者外周血中上述指標。

1.2.5 療效觀察 療效觀察指標：(1)治療組接受細胞免疫治療前后外周血免疫功能指標的變化。(2)治療期間詳細觀察患者癥狀、體征變化，于治療前、后分別檢測患者外周血白細胞、肝功能及腎功能。(3)每隔3月復查胸部CT、腹部B超和CT，了解有無復發轉移，密切觀察是否出現各種不良反應，并記錄發生時間、表現及轉歸。不良反應按照美國國立癌癥研究所制定的毒性評價標準NCI(急性和亞急性毒性反應的表現和分度標準)進行評估分級。

生活質量改善評定標準：顯效為KPS評分提高≥20分；有效為KPS評分提高≥10分；無效為KPS評分提高<10分或不變甚至減低。治療結束后1月評價有效率，同時密切觀察2組患者治療前后的食欲、睡眠及精神狀況。

有效率(%)=[(顯效病例+有效病例)/全部病例]×100%

1.2.6 隨訪 全部病例均進行隨訪觀察，采用復查、信件或電話等方法進行隨訪，內容包括生存情況及不良反應等。隨訪截止日期2016年5月，隨訪時間為9～112月。以無進展生存期(progression free survival, PFS)和總生存期(overall survival, OS)作為觀察指標。PFS指從開始手術治療到腫瘤進展或死亡的時間；OS指從開始手術治療到死亡的時間或隨訪截止時間。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，生存分析采用Kaplan-Meier 法并行Log-rank檢驗，率檢驗采用χ2檢驗，2組均數的比較采用t檢驗。將單因素分析有意義的因素引入COX比例風險模型進行多因素分析。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 抗原負載前后DC形態及培養后DC-CIK細胞表型流式檢測結果 DC培養至第3天，DC表面可見觸角樣突起(圖1A)；培養至第5天，加入自體MM抗原后，可見DC因捕獲吞噬抗原顏色加深體積增大，觸角樣突起增多(圖1B)。將培養3 d的DC進行流式檢測成熟度指標，CD86，HLA-DR，CD83及CD80表達量低(圖1C)；培養7 d后，CD86，HLA-DR，CD83及CD80表達量>90%(圖1D)。DC-CIK細胞混合培養第10天對CIK細胞進行流式檢測，較外周血單核細胞中CD3+CD4+細胞減少，CD3+CD8+及CD3+CD(16+56)+效應細胞大量增加(圖1E，表1)。

表1 DC-CIK細胞表型分析結果

A：顯微鏡下未成熟DC形態( ×400)；B：負載抗原后DC捕獲抗原( ×400)；C：未成熟DC流式檢測結果；D：成熟DC流式檢測結果；E：培養后CIK細胞流式檢測結果.圖1 抗原負載前后DC形態及培養后DC-CIK細胞表型流式檢測結果Fig 1 DC morphology and the flow cytometry result of DC-CIK cell phenotype

2.2 治療組和對照組的OS和PFS比較 治療組死亡19例；對照組死亡34例。治療組的中位生存時間為45月，優于對照組的29月。Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank test檢驗結果表明，2組患者的OS比較，差別有統計學意義(χ2=5.639，P=0.018，圖2A)。治療組和對照組的中位PFS分別為18及16月。Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank test檢驗結果表明，2組差別無統計學意義(χ2=1.351，P=0.245，圖2B)。

2.3 治療組治療后免疫功能變化 經DC-CIK細胞免疫治療后，治療組患者外周血單核細胞中CD3+CD4+雙陽性細胞比例及CD4+/CD8+比值較治療前提高，CD3+細胞和CD3+CD8+雙陽性細胞比例較治療前顯著提高(表2)。

2.4 MM的獨立預后因素 將可能影響預后的各因素進行單因素分析，結果顯示：是否進行DC-CIK治療(χ2=5.639，P=0.018)、DC-CIK治療療程數(χ2=5.397，P=0.02)以及是否有淋巴結轉移(χ2=7.445，P=0.006)是MM的預后影響因素；性別、年齡及原發部位對預后無影響(P>0.05，表3)。將單因素分析中對預后有影響的因素，是否進行DC-CIK治療、DC-CIK治療療程數以及是否有淋巴結轉移納入COX比例風險模型進行多因素分析，結果表明：是否進行DC-CIK治療、DC-CIK治療療程數以及有無淋巴結轉移是影響MM預后的獨立因素(P<0.05，表4)。

OS：總生存期； PFS：無進展生存期.圖2 治療組與對照組總生存期及無進展生存期曲線Fig 2 The survival or progression free survival curves of the treatment group and the control group

表2DC-CIK細胞免疫治療前后患者T細胞亞群變化

Tab2Changes of T cell subsets before and after the treatment with DC-CIK cells

T細胞亞群治療前治療后CD3+46．87±9．3259．65±10．27☆☆CD3+CD4+24．44±7．8532．54±5．62☆CD3+CD8+17．65±5．7623．76±6．53☆☆CD4+/CD8+1．12±0．581．37±0．41☆CD3-CD(16+56)+12．76±8．3213．11±7．14

表中數據除CD4+/CD8+為比值外其余均為%. 與治療前比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

表3惡性黑色素瘤患者臨床預后因素的單因素分析

Tab3Univariate analysis of clinical prognostic factors in patients with malignant

分 組t中位生存期/月χ2Log-rankP性別0．7420．389 男性32 女性37年齡/歲0．8560．355 ≤5032 >5047DC-CIK治療5．6390．018☆ 是55 否30DC-CIK治療療程5．3970．02☆ <432 ≥453原發部位0．5890．443 皮膚31 黏膜39淋巴結轉移7．4450．006☆☆ 是28 否47

☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.5 治療后生活質量改善情況 對照組及治療組治療后生活質量的改善有效率分別為57.5%及78.4%，2組比較差別有統計學意義(P<0.01，表5)，且治療組治療后自我感覺良好，體力增強，睡眠質量和食欲均有顯著改善。

2.6 DC-CIK治療的不良反應 接受DC-CIK治療的患者中，僅2例在細胞回輸后出現發熱和畏寒，24 h內自行或經對癥處理后恢復正常，不良反應未達3/4級。

表4 惡性黑色素瘤患者臨床預后因素的多因素分析

表52組患者治療前后生活質量改善情況

Tab5Comparison of quality of life before and after the treatment

分 組n總n顯效n有效n無效有效率/%對照組404191757．5治療組37821878．4☆

與對照組比較，☆：P<0.01.

3 討 論

MM是一種惡性程度較高的腫瘤，常發生廣泛轉移。對于早期還未發生淋巴結轉移的患者，手術切除原發灶或行原發灶擴大切除術可治愈部分患者。而對于已發生淋巴結轉移的早期患者或已發生遠處轉移的中晚期患者，治療上應以手術為主，輔以其他相關治療，但臨床數據顯示，因MM對放療及化療的敏感性差，臨床治療難度大，有效率低[10-11]。由于MM發生轉移早，真正早期發現無轉移或微轉移的患者較少。因此，尋求各種治療方法以延長MM患者的生存期是治療的關鍵。

DC是目前已知的人體內抗原加工和提呈功能最強的細胞，能夠在機體內激發T細胞應答，在腫瘤特異性免疫中發揮主導作用，處于免疫應答的中心環節[12]。CIK細胞是人外周血單個核細胞在體外經過多種細胞因子共同刺激后，誘導培養獲得的一群異質細胞，其中CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞是CIK細胞中的主要效應細胞，兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性與NK細胞的非MHC的限制性殺瘤優點。腫瘤組織裂解總蛋白中包含豐富的MHC抗原表位成分，經過DC細胞的攝取、加工和提呈后，可誘導產生針對該抗原的特異性細胞毒性T淋巴細胞，從而發揮特異性的抗腫瘤作用。抗原負載后的DC在體外制成DC疫苗，經皮內、皮下或靜脈輸入機體，目前已被試用于MM及前列腺癌等多種腫瘤的臨床治療[13-14]。王忠成等認為，抗原負載的DC-CIK和DC有明顯的抗腫瘤作用[15]。

本研究使用MM組織裂解總蛋白負載DC制備瘤苗，通過皮下注射和共培養DC-CIK以保證CIK細胞的特異性殺傷作用。在治療時機上，選擇在手術切除原發灶后進行DC-CIK細胞回輸，減小腫瘤負荷后，最大限度地發揮DC-CIK細胞清除術后體內殘存的腫瘤細胞和微小病灶，延長生存期，降低腫瘤轉移和復發的作用。結果顯示，對照組和治療組的3年生存率分別為35%及57.6%，5年生存率分別為12.5%及27.3%，中位OS分別為29及45月。雖治療組的PFS未見明顯改善，但其OS較對照組顯著延長，免疫功能和生活質量顯著提高，且僅2例患者在回輸后出現發熱和畏寒，不良反應未達到3/4級，證明DC-CIK細胞治療可顯著延長MM患者的生存時間，且治療過程安全性高，無明顯副作用。

單因素分析結果顯示，是否有淋巴結轉移、是否進行DC-CIK治療以及治療的療程數是影響細胞治療療效和患者預后的影響因素。多因素COX回歸分析提示，是否有淋巴結轉移、是否進行DC-CIK治療以及治療療程數是獨立預后因子。說明進行DC-CIK治療不僅可以延長MM患者的生存期，隨著治療療程的增加，還可以獲得更加良好的預后。文獻報道，影響患者預后的因素還包括腫瘤大小、浸潤深度及腫瘤分期等[16]。但由于本研究中，不同發病部位的MM無明確統一的分期標準，所以對MM的預后因素分析還不夠全面，筆者將在今后的研究中進一步擴大樣本量，以期得到更全面的數據分析。

目前，美國FDA已批準上市阻斷PD-1細胞通路的的藥物Keytruda(藥品名：Pembrolizumab，德國默克公司)，用于治療晚期MM，被譽為治療MM的“超級對癥藥”，該藥可將約15%的晚期MM患者的5年生存率提高到35.3%。在一項大型隨機臨床試驗KEYNOTE-001(NCT01295827)中，Pembrolizumab在655位晚期MM患者中，客觀反應率達33%，2年生存率達49%，14%的患者發生了治療相關的3/4級不良事件，9%的患者發生了嚴重不良反應事件[17]。由于PD-1抗體藥物在提高客觀有效率以及延長患者的總生存時間上的優異表現，已被納入治療晚期MM的一線藥物名單。然而，PD-1抗體藥物的副作用和高昂的費用也不容忽視。目前我國大陸地區還未引進此類PD-1抗體藥物，而DC-CIK細胞治療在長達十幾年的臨床使用中，在延長患者的生存期、提高患者生活質量、治療安全無明顯副作用以及治療費用等方面均表現突出，不失為一種安全成熟、可操作性較高、患者愿意接受的有效輔助治療手段。

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(編輯：何佳鳳)

Efficacy of Dendritic and Cytokine-Induced Killer Cells on Postoperative Patients with Malignant Melanoma

LIU Shijia, XIE Yunqing, GONG Fusheng, CHEN Luchuan, WEI Shenhong, YING Mingang, ZHENG Qiuhong

Fujian Provincial Key Laboratory of Tumor Biotherapy, Fujian Provincial Tumor Hospital, Teaching Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou350014, China

Objective To observe the efficacy and safety of the application of dendritic and cytokine-induced killer (DC-CIK) cells on postoperative patients with malignant melanoma. Methods A total of 77 patients with malignant melanoma were recruited from May 2004 to May 2013. DC-CIK therapy was given to 37 patients after surgery in the treatment group, whereas the other 40 patients in the control group only

surgical treatment. Follow-up was conducted for the patients in the two groups. Overall survival (OS), progression free survival (PFS), immunologic function, Karnofsky performance status (KPS), and adverse reactions were compared. Univariate and multivariate analysis of survival were also carried out. Results The median OS was 45 months in the DC-CIK group and 29 months in the control group. The OS in the DC-CIK group was higher than that in the control group (P=0.018), while there was no significant difference in PFS between the two groups (P=0.245). However the immune function and quality of life were significantly improved for the DC-CIK group (P<0.05) and only two patients in DC-CIK group had adverse reactions, which were less than grade 3/4. Multivariate analysis showed that lymph node metastasis (P=0.008), DC-CIK therapy (P=0.02), and DC-CIK therapy cycle (P=0.031) were independent prognostic parameters. Conclusion DC-CIK cell immunotherapy may prolong the survival of malignant melanoma patients and is safe and with tolerable adverse reactions. It can improve immune function and the quality of life of patients with malignant melanoma. If a patient received more than 4 DC-CIK cycles, it might produce greater clinical benefits.

melanoma; dendritic cells; cytokines; killer cells

福建省醫學創新課題(2015-CXB-4)；福建省自然科學基金(2016J01514)

福建醫科大學教學醫院，福建省腫瘤醫院，福建省腫瘤生物治療重點實驗室，福州 350014

劉施佳，女，技師，醫學碩士

鄭秋紅. Email:zqh2858@foxmail.com

R329.24； R457.2； R739.5

: A

: 1672-4194(2017)04-0217-06