中國(guó)廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873遺傳多態(tài)性研究

黃華佗， 陸玉蘭， 王 榮， 向 陽(yáng)， 李北林， 韋葉生

中國(guó)廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873遺傳多態(tài)性研究

黃華佗， 陸玉蘭， 王 榮， 向 陽(yáng)， 李北林， 韋葉生

目的研究rs1491034和rs982873單核苷酸多態(tài)性(SNPs)在廣西人群中的分布特點(diǎn)，比較二者基因型和等位基因在不同種族、地區(qū)人群間的分布差別。方法采用SNaPshot SNP分型技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)397例廣西人群rs1491034和rs982873 SNPs，比較兩位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖(HapMap)計(jì)劃公布的不同種族和地區(qū)人群間的差別。結(jié)果廣西人群rs1491034和rs982873均存在TT，CT及CC 3種基因型。2個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在廣西人群不同性別間比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。廣西人群rs1491034基因型和等位基因頻率與HapMap-CEU和HapMap-YRI人群比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而rs982873基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與其他人群比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論廣西人群存在rs1491034和rs982873多態(tài)性，與其他種族、地區(qū)人群比較存在不同程度的差別。

多基因族； 啟動(dòng)區(qū)(遺傳學(xué))； 多態(tài)現(xiàn)象, 遺傳； 大陸人口群

微小RNA(microRNA, miRNA)是基因調(diào)控領(lǐng)域的又一重大發(fā)現(xiàn)，通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生降解或翻譯抑制，從而在翻譯水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[1-2]。miRNA有成簇的聚集在染色體上的特點(diǎn)，通過(guò)一個(gè)共同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄生成多順?lè)醋印Ｔ诨虼氐难芯糠矫妫壳把芯康幂^為深入的是微小RNA-17-92(microRNA-17-92, miRNA-17-92)基因簇。miRNA-17-92基因簇參與大量靶基因翻譯的調(diào)控，參與正常人肺和心臟發(fā)育以及血管新生[3]。然而，在某些病理情況下，miRNA-17-92基因簇可促進(jìn)腫瘤、免疫性疾病和心腦血管疾病等的發(fā)生和發(fā)展[4-6]。miRNA-17-92基因簇位于13號(hào)染色體長(zhǎng)臂(13q31.3)miRNA-17-92基因簇的宿主基因(miRNA-17-92 cluster hostgene, MIR17HG)內(nèi)，可編碼生成6種成熟的miRNA(miRNA-17，miRNA-18a，miRNA-19a，miRNA-20a，miRNA-19b-1及miRNA-92a-1)。研究表明，miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性可影響miRNA的轉(zhuǎn)錄以及miRNA基因相關(guān)疾病的遺傳易感性，從而導(dǎo)致miRNA相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[7-9]。

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，基因多態(tài)性的研究更多地趨向于局部的、多民族和多地區(qū)的分散研究。廣西正常人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)遺傳多態(tài)性的研究可為后期miRNA-17-92基因簇相關(guān)疾病遺傳多態(tài)性研究和群體遺傳學(xué)研究提供參考資料。筆者采用SNaPshot SNP分型技術(shù)和DNA測(cè)序法檢測(cè)miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873遺傳多態(tài)性，并將所得分型數(shù)據(jù)與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃公布的HapMap-CEU、HapMap-HCB、HapMap-JPT和HapMap-YRI人群結(jié)果比較，分析不同種族、地區(qū)人群間兩位點(diǎn)的遺傳差別。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者397例，男性237例，女性160例，年齡(61.33±9.91)歲(27～83歲)，通過(guò)各項(xiàng)血液和影像學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)腫瘤以及肝臟、腎臟、心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，排除遺傳病家族史。本研究對(duì)象均為相互間無(wú)血緣關(guān)系的廣西地區(qū)人群。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 用EDTA-K2抗凝的血常規(guī)管采集研究對(duì)象靜脈血3 mL，置于-50 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩；蚪MDNA提取采用試劑盒離心柱法(TIANamp Blood DNA Kit)，提取后的DNA標(biāo)本放在-50 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 查詢NCBI SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，分別選取包含rs1491034和rs982873位點(diǎn)的適宜長(zhǎng)度DNA片段，用網(wǎng)頁(yè)引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0設(shè)計(jì)PCR引物，交由上海天昊生物科技有限公司合成。引物序列：

rs1491034：

上游：TGGGGTTTCTTCAGGGGATAATTG

下游：TGTTCTGAGTGGAGGGCCCTTAT

延伸引物：TAATCCTGAAATTCCCCCAATTA

rs982873：

上游：CCTTGTCCGGCAATCATGAAGT

下游：CAACATTCCCAAAGTCCGTGACA

延伸引物：TTTTTTGAAACACAAATTCTCCTTGA ATTTC

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)包含1×GC-I buffer(Takara)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物，不足的體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)充。PCR產(chǎn)物用5U SAP酶和2U Exonuclease I酶純化后用SNaPshot Multiplex Kit(ABI)進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物加入1U SAP酶純化后上ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co Ltd，USA)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 基因型和等位基因的頻率用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算。基因型和等位基因數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)型資料，不同組間基因型和等位基因頻率比較分別用行×列表卡方檢驗(yàn)(χ2)和四格表χ2檢驗(yàn)計(jì)算。采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873分型 測(cè)序結(jié)果表明，rs1491034位點(diǎn)包含TT,TC和CC 3種基因型，其頻率分別為25.2%，52.6%和22.2%；T和C等位基因頻率分別為51.5%和48.5%。rs982873位點(diǎn)包含TT，TC和CC 3種基因型，其頻率分別為37.5%，48.1%和14.4%，T和C等位基因頻率分別為61.6%和38.4%。基因測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果(圖1，2)。

A～C：箭頭指向分別表示TT，TC及CC基因型.圖1 miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034測(cè)序圖Fig 1 Sequencing map for rs1491034 in the promoter of miRNA-17-92 cluster

A～C：箭頭指向分別表示TT，TC及CC基因型.圖2 miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs982873測(cè)序圖Fig 2 Sequencing map for rs982873 in the promoter of miRNA-17-92 cluster

2.2 廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873遺傳多態(tài)性在不同性別間的比較 經(jīng)χ2驗(yàn)證，miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873基因型數(shù)據(jù)均符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)(P=0.28；P=0.74)，表明本研究所選的對(duì)象具有群體代表性。rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率在不同性別間比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，P>0.05)。

表1中國(guó)廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率在不同性別間的比較

Tab1Comparison of the genotype and allele frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of miRNA-17-92 cluster between genders

SNPs性別nn基因型(%)TTTCCCn等位基因(%)TCrs1491034男性23755(23．2)127(53．6)55(23．2)237(50．0)237(50．0)女性16045(28．1)82(51．3)33(22．2)172(53．7)148(46．3)rs982873男性23791(38．4)110(46．4)36(15．2)292(61．6)182(38．4)女性16058(36．3)81(50．6)21(13．1)197(61．6)123(38．4)

SNPs：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性.

2.3 中國(guó)廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率與其他種族、地區(qū)人群比較 廣西人群rs1491034基因型和等位基因頻率與HapMap-CEU和HapMap-YRI人群比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但與HapMap-HCB和HapMap-JPT人群比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，3)。廣西人群rs982873基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與HapMap-HCB人群比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，3)。

表2中國(guó)廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873基因型頻率與其他種族、地區(qū)人群比較

Tab2The comparison between genotype frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of the miRNA-17-92 cluster in Guangxi Chinese population and different other races, districts population

SNPs人 群nn基因型(%)TTTCCCHWEχ2Prs1491034廣西人群397100(25．2)209(52．6)88(22．2)0．28--HapMap?HCB9022(24．4)46(51．1)22(24．4)0．830．220．90HapMap?JPT8828(31．8)48(54．5)12(13．6)0．233．790．15HapMap?CEU12086(71．7)34(28．3)-0．0793．52<0．01HapMap?YRI12078(65．0)40(33．3)2(1．7)0．2271．80<0．01rs982873廣西人群397149(37．5)191(48．1)57(14．4)0．74--HapMap?HCB9026(28．9)48(53．3)16(17．8)0．452．510．29HapMap?JPT8820(22．7)42(47．7)26(29．5)0．7014．240．01HapMap?YRI1206(5．0)24(20．0)90(75．0)0．02169．22<0．01

SNPs：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性； HWE： 哈迪-溫伯格定律； HCB： 中國(guó)北京漢族人群； JPT： 日本東京人群； CEU： 具有北歐和西歐血統(tǒng)的猶他州人群； YRI：在非洲尼日利亞伊巴丹的約魯巴人.

3 討 論

miRNA存在pri-miRNA、前體miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA)和成熟miRNA 3種類(lèi)型，通過(guò)不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合到目的mRNA的3′非翻譯區(qū)，導(dǎo)致靶基因的mRNA發(fā)生降解或翻譯抑制，調(diào)控眾多基因的表達(dá)[1,10]。研究表明，一種miRNA可調(diào)控多達(dá)數(shù)百個(gè)目的基因mRNA的表達(dá)，而一個(gè)mRNA的表達(dá)也可由多種miRNA共同調(diào)節(jié)，雖然目前發(fā)現(xiàn)的miRNA只有幾百個(gè)，但miRNA卻調(diào)節(jié)著超過(guò)1/3的生物基因[2]。miRNA-17-92基因簇是目前研究得最多也是研究得最深入的miRNA基因簇之一，與生物正常生長(zhǎng)發(fā)育以及腫瘤、免疫性疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性病變等疾病的發(fā)生均有著密切聯(lián)系，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3-4,11-12]。

表3中國(guó)廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873等位基因頻率與其他種族、地區(qū)人群的比較

Tab3The comparison between allele frequency of rs1491034 and rs982873 polymorphisms in the promoter of the miRNA-17-92 cluster in Guangxi Chinese population and different other races, districts population

SNPs人 群nn等位基因(%)TCχ2Prs1491034廣西人群794409(51．5)385(48．5)--HapMap?HCB18090(50．0)90(50．0)0．130．71HapMap?JPT176104(59．1)72(40．9)3．320．07HapMap?CEU240206(85．8)34(14．2)90．08<0．01HapMap?YRI24067(29．6)318(70．4)69．04<0．01rs982873廣西人群794489(61．6)305(38．4)--HapMap?HCB180100(55．6)80(44．4)2．230．14HapMap?JPT17682(46．6)94(53．4)13．38<0．01HapMap?YRI24036(15．0)204(85．0)160．03<0．01

SNPs：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性；HWE：哈迪-溫伯格定律；HCB：中國(guó)北京漢族人群；JPT：日本東京人群；CEU：具有北歐和西歐血統(tǒng)的猶他州人群；YRI：在非洲尼日利亞伊巴丹的約魯巴人.

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)指在基因組的水平上由于單個(gè)核苷酸突變引起的DNA序列多態(tài)性，為人類(lèi)可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種。SNPs的研究在解釋不同群體、個(gè)體對(duì)疾病特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性和對(duì)各種藥物的耐受性以及對(duì)環(huán)境因子反應(yīng)的表型差別方面起著很大的作用。人類(lèi)基因組計(jì)劃掃描發(fā)現(xiàn)，miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)存在功能性SNPs位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的SNPs改變可能會(huì)影響miRNA-17-92基因簇的表達(dá)，從而影響miRNA-17-92基因簇調(diào)控的靶基因相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本研究結(jié)果表明，廣西人群rs1491034和rs982873基因型和等位基因頻率在不同性別間比較,差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明廣西人群rs1491034和rs982873 SNPs無(wú)性別間差別。進(jìn)一步將rs1491034和rs982873分型結(jié)果與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃公布的4個(gè)人群數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，rs1491034基因型和等位基因頻率與HapMap-CEU 和HapMap-YRI人群比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，然而與HapMap-HCB及HapMap-JPT人群比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而rs982873基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT和HapMap-YRI人群比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與HapMap-HCB人群比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HapMap-CEU 和HapMap-YRI人群與廣西人群屬于不同種族，地緣關(guān)系遠(yuǎn)，且飲食和生活習(xí)慣上存在較大差別，因此與廣西人群比較遺傳差別大。而HapMap-HCB和HapMap-JPT人群與廣西人群同屬亞洲人，地理位置和親緣關(guān)系近，因此與廣西人群比較遺傳差別相對(duì)較小。廣西人群rs1491034T等位基因頻率為51.5%，與同是亞洲人的HapMap-HCB(50.0%)和HapMap-JPT(59.1%)人群T等位基因頻率相近，而與HapMap-CEU(85.8%)和HapMap-YRI(81.7%)人群的T等位基因頻率相差較遠(yuǎn)。類(lèi)似的，廣西人群rs982873T等位基因頻率為61.6%，與同是亞洲人的HapMap-HCB(55.6%)和HapMap-JPT(46.6%)人群T等位基因頻率相近，而與HapMap-YRI(15.0%)人群T等位基因頻率相差較遠(yuǎn)。以上結(jié)果均與“親緣關(guān)系越近，基因型的分布差別越小”的遺傳定律相吻合。基因多態(tài)有不同民族、種族和地區(qū)間的差別，雖然廣西人群與HapMap-HCB及HapMap-JPT人群同屬于亞洲人，但由于各地方的地理位置、環(huán)境和氣候有所不同，飲食和生活習(xí)慣上也有較大差別，因此三者的基因型和等位基因比較也表現(xiàn)出一定差別，甚至出現(xiàn)廣西人群rs982873位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與HapMap-JPT人群比較出現(xiàn)較大差別的結(jié)果。

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，基因多態(tài)性的研究更多地趨向于局部的、多民族和多地區(qū)的分散研究。基因多態(tài)性研究的展開(kāi)在解釋不同群體、個(gè)體對(duì)疾病特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性和對(duì)各種藥物的耐受性以及對(duì)環(huán)境因子反應(yīng)的表型差別方面都起著很大的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西人群存在miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873遺傳多態(tài)性，其基因型和等位基因頻率與不同種族、地區(qū)人群比較存在不同程度的差別。廣西人群miRNA-17-92基因簇啟動(dòng)子區(qū)rs1491034和rs982873遺傳多態(tài)性的研究可為群體遺傳學(xué)和miRNA-17-92基因簇相關(guān)疾病的研究提供參考資料，同時(shí)可為廣西地區(qū)建立區(qū)域基因數(shù)據(jù)庫(kù)貢獻(xiàn)一份力量。

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(編輯:張慧茹)

Exploration of Genetic Polymorphism of rs1491034 and rs982873 in the Promoter of miRNA-17-92 Cluster in China Guangxi Population

HUANG Huatuo, LU Yulan, WANG Rong, XIANG Yang, LI Beilin, WEI Yesheng

Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise533000, China

Objective To explore the distribution characteristics of the rs1491034 and rs982873 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in Guangxi populations, and to compare their genotype and allele frequency with different races and populations of other regions. Methods The SNPs of rs1491034 and rs982873 were detected by SNaPshot SNP and DNA sequencing methods. We statistically analyzed the difference between the genotype and allele frequency of the two SNPs that we studied and compared it with the data of different races and regional populations, while were published in the international HapMap project. Results The rs1491034 and rs982873 SNPs contain TT, TC and CC genotypes, respectively, in the Guangxi population. The genotype and allele distribution of the two SNPs were not significantly different between genders in the Guangxi population (P>0.05). The genotype and allele distribution of the rs1491034 SNP were significantly different from HapMap-CEU and HapMap-YRI populations (P<0.01), and the genotype and allele distribution of the rs982873 SNP were significantly different from HapMap-JPT and HapMap-YRI populations (P<0.05). However, the genotype and allele distribution of the two SNPs were not significantly different compared with other listed population. Conclusion There are rs1491034 and rs982873 SNPs in the Guangxi population, and there are varying degree of differences in the genotype and allele distribution of the two polymorphism between the Guangxi populations and other published populations of races/regions.

multigene family； promoter regions (genetics)； polymorphism, genetic； continental population groups

2017-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(81560552；81260234)；廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(kfkt20160064);廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(201601009)

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，百色 533000

黃華佗，男，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技師，醫(yī)學(xué)碩士

韋葉生.Email: yeshengwei22@163.com

R34； R394.3； R394.5

: A

: 1672-4194(2017)04-0212-05