重組人胰島素樣生長因子-1對坐骨神經損傷的修復作用

黃慧慧, 楊 漸, 俞昌喜

重組人胰島素樣生長因子-1對坐骨神經損傷的修復作用

黃慧慧, 楊 漸, 俞昌喜

目的在大鼠坐骨神經鉗夾損傷模型上，探討重組人胰島素樣生長因子-1(hIGF-1)融合蛋白的治療作用。方法40只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組及hIGF-1融合蛋白高(0.02 mg)、低(0.002 mg)劑量處理組，建立大鼠坐骨神經鉗夾損傷模型；以大鼠行為學、坐骨神經功能指數(SFI)、坐骨神經-腓腸肌誘發電位、組織形態學變化為指標，綜合考察hIGF-1融合蛋白對損傷坐骨神經的影響。結果術后20～32 d，各測定時間點hIGF-1融合蛋白高、低劑量組大鼠SFI值及SFI恢復率顯著高于模型組(P<0.05)，作用呈劑量依賴性。術后35 d，hIGF-1融合蛋白高、低劑量組大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發電位振幅顯著高于模型組(P<0.01)，作用隨劑量增大而增強。H-E染色顯示，hIGF-1融合蛋白高、低劑量組大鼠坐骨神經損傷區再生神經排列較模型組規則，有髓神經纖維增多，髓鞘較厚且完整。結論重組hIGF-1融合蛋白能促進大鼠坐骨神經損傷的修復。

胰島素樣生長因子-1； 坐骨神經； 坐骨神經病； 大鼠

人胰島素樣生長因子-1(human insulin-like growth factor-1，hIGF-1)在神經細胞分化、物質代謝、個體生長發育中起著極為重要的作用，其異常與糖尿病、胰島素抵抗、骨骼發育不良、腎功能衰竭等多種疾病密切相關[1-5]。其中，周圍神經損傷發生率高，治療困難，是當今醫療面臨的難題之一。然而，在周圍神經損傷時內源性的hIGF-1已不能滿足神經功能恢復的需要，補充外源性hIGF-1對其可能具有治療作用，具有開發利用價值。課題組前期通過基因重組技術在大腸桿菌表達并已以鈷金屬螯和親和層析技術分離純化獲得較高純度重組hIGF-1融合蛋白[6]，為考察其藥理活性，選用大鼠坐骨神經鉗夾損傷模型，探討其對坐骨神經損傷后神經再生與功能修復的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar大鼠40只，體質量200～250 g，清潔級[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005]。動物均在光暗周期12/12 h、溫度21～25 ℃、濕度45%～55%的環境飼養，自由飲水進食。所有針對大鼠的實驗操作均遵守國際及本地實驗動物使用和保護委員會頒布的條例。

1.1.2 試劑 hIGF-1融合蛋白干粉由福建醫科大學藥學院神經藥理課題組提供，純度約95%，用生理鹽水配制成所需濃度溶液；水合氯醛(天津科密歐化學試劑有限公司)；青霉素鈉粉針劑(華北制藥股份有限公司)；其余試劑為國產分析純。

1.1.3 儀器 多道生理信號采集處理系統(RM6240B，成都儀器廠)；全自動顯微照相裝置(日本奧林巴斯公司)；組織包埋機(日本櫻花檢驗儀器株式會社)；石蠟切片機(德國萊卡公司)；自動組織脫水機(德國萊卡公司)；推片烤片機(宏業醫用儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠坐骨神經鉗夾損傷模型 參照文獻[7]的方法，將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取俯臥位，無菌條件下沿股骨走向切開右下肢臀大肌，暴露坐骨神經干，在距梨狀肌下緣約8 mm處用特制無齒血管鉗末端鉗夾坐骨神經干1 min，造成寬度約3 mm的損傷區，5-0絲線標記后縫合。術后腹腔注射青霉素10萬U預防感染，每天1次，持續3 d。

1.2.2 坐骨神經功能指數(sciatic functional index,SFI)測定 參照文獻[8-9]，建模后4 d行足跡實驗。在足跡行走箱底墊入與箱底等大白紙，將大鼠雙后足浸入黑色碳素墨水染色后由行走箱右側面放入(圖1)，大鼠自行走向暗室端并由另一端開口走出，記錄3～4個清晰的足印，晾干測量。正常側記為N(Normal)，手術側記為E(Experimental)，測定以下3個指標：(1)足印長度(print length，PL)：從足跟到足尖的最長距離；(2)足趾寬度(toe spread，TS)：第1趾到第5趾連線距離；(3)中間足趾距離(intermediary toe-spread，IT)：第2趾到第4趾連線距離。每次測量取最大一組數據，精確到mm。根據Bain公式計算SFI值[8]：

正常時SFI=0，坐骨神經完全離斷時SFI=-100。同時計算SFI恢復率。

圖1 大鼠足跡行走箱Fig 1 Diagram of footprints collection box

1.2.3 坐骨神經-腓腸肌誘發電位測定 采用1.2.1方法暴露坐骨神經，將作為刺激電極(雙極鉤保護電極)刺入坐骨神經干上距梨狀肌下緣約5 mm處，記錄電極(同芯針電極)則插入腓腸肌中，給予電壓2 V、波寬2 ms的單個方波脈沖刺激，記錄其波形，并計算振幅；鉗夾損傷術前測1次，術后再次測定，二者比較，驗證鉗夾損傷對坐骨神經動作電位傳導功能的影響。

1.2.4 組織形態學觀察 電位測定完畢迅速切下包括鉗夾傷部位在內的上下各5 mm坐骨神經干，隨即浸入10%甲醛過夜固定，經酒精梯度脫水后，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅(H-E)染色，顯微鏡下觀察形態。

1.2.5 實驗設計 大鼠隨機分為假手術組、模型組、hIGF-1融合蛋白高劑量(0.1 mg/mL)處理組和低劑量(0.01 mg/mL)處理組，每組10只。行坐骨神經鉗夾損傷術。假手術組暴露坐骨神經干后，只打一個松結，不鉗夾。模型組與hIGF-1高、低劑量處理組建模方法同前。取一大小為0.5 cm×0.5 cm的無菌吸收性明膠海綿，輕輕壓扁后用1 mL注射器小心注入液體0.2 mL使其蘸滿(假手術組、模型組給予生理鹽水，hIGF-1高、低劑量組分別為0.1 mg/mL與0.01 mg/mL濃度的hIGF-1融合蛋白溶液)，覆蓋于損傷處或標記線結表面，如前縫合并給予青霉素預防感染；各組大鼠于術后4，8，12，16，20，24，28，32 d分別測定SFI；術后35 d，10%水合氯醛麻醉大鼠，同1.2.3法給予電刺激并記錄坐骨神經-腓腸肌誘發電位的波形，計算振幅；電位記錄完畢，快速切下線結標記上下各0.5 cm段坐骨神經干，剪去線結，隨即泡入10%福爾馬林固定備用，行H-E染色。

2 結 果

2.1 大鼠行為學觀察 術后2 d，各組大鼠術肢均有不同程度的足趾紅腫、下垂、無法伸展癥狀。其中假手術組大鼠行走時術肢以足底著地，呈跛行步態；模型組及hIGF-1融合蛋白高、低劑量處理組則以足背部著地呈拖曳步態；術后4 d，模型組及hIGF-1融合蛋白高、低劑量處理組大鼠行走時術肢可以足底及膝關節著地，呈趾屈曲跛行步態,各組無明顯差別；術后21 d，假手術組大鼠行走步態基本正常，活動靈活，hIGF-1融合蛋白高、低劑量處理組次之，模型組最差；各組大鼠無死亡，傷口無感染，愈合良好。

2.2 hIGF-1融合蛋白對鉗夾損傷大鼠SFI的影響 各組大鼠SFI值及其隨時間變化情況見圖2。術后4～32 d各個測定時間點模型組大鼠SFI值與假手術組比較，差別均有統計學意義(P<0.05)；術后20 d開始，hIGF-1融合蛋白高劑量組、低劑量組SFI值較模型組顯著增高(P<0.05)，作用隨劑量增大而增強，持續12 d。SFI恢復率結果顯示，術后4～32 d各測定時間點模型組大鼠SFI恢復率顯著低于假手術組(P<0.05)；術后20～32 d，hIGF-1融合蛋白高、低劑量組大鼠SFI恢復率較模型組顯著增高(P<0.05)，作用隨劑量增大而增強(表1)。

2.3 hIGF-1融合蛋白對鉗夾損傷大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發電位的影響 術后35 d，再次測定各組大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發電位，記錄波形(圖3)。假手術組波形與術前較為相似，提示與正常時接近；而模型組波形不規則，振幅小，時限寬；hIGF-1融合蛋白高、低劑量組的波形則較為規則，振幅較大。經計算分析，模型組大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發的動作電位振幅降低，與假手術組比較，差別具有統計學意義(P<0.01)；hIGF-1融合蛋白高、低劑量組動作電位振幅較模型組顯著增高(P<0.01)(圖4)。

2.4 hIGF-1融合蛋白對鉗夾損傷大鼠坐骨神經形態的影響 H-E染色形態學觀察顯示，假手術組大鼠坐骨神經損傷區神經纖維排列整齊，髓鞘完整，密度高，與正常神經纖維無明顯區別(圖5)。模型組再生神經纖維較細，數目少，排列紊亂、不規則，髓鞘較薄，部分神經纖維未見髓鞘和軸突。hIGF-1融合蛋白高、低劑量組損傷區鏡下表現相似，橫切面染色結果顯示，軸突髓鞘較完整，低劑量組的神經纖維相對高劑量組松散；縱切面可見神經纖維排列較為整齊，施旺細胞較多，部分已連成有序的條索狀。

表1 術后不同時間各組大鼠SFI恢復率

n=10. Sham：假手術； Model：模型； hIGF-1：重組人胰島素樣生長因子-1; SFI：坐骨神經功能指數. “-”：SFI恢復率為負值. 與假手術組比較，△：P<0.05，△△：P<0.01； 與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01.

n=10. SFI：坐骨神經功能指數. Sham：假手術； Model：模型； hIGF-1：重組人胰島素樣生長因子-1. 與假手術組比較，☆：P<0.05, ☆☆：P<0.01； 與模型組比較，#：P<0.05, ##：P<0.01.圖2 hIGF-1融合蛋白對鉗夾損傷大鼠坐骨神經功能指數的影響Fig 2 Effect of hIGF-1 fusion protein on SFI in rats with sciatic nerve crush injured

3 討 論

周圍神經損傷后，軸突再生的數目與質量決定了神經功能的恢復情況[10]。研究指出，IGF-1具有促進施旺細胞增殖和存活，抑制其凋亡，促進神經損傷后軸突再生和髓鞘化，參與神經元的保護、損傷后突觸的重構以及抑制神經肌肉萎縮等作用[11-12]，表明神經營養因子IGF-1既能有效促進神經損傷的修復與生長又能保證再生神經纖維的功能。因此，筆者通過探討采用基因重組技術獲得的高純度hIGF-1融合蛋白對周圍神經損傷的治療作用，為其可能研制成治療周圍神經損傷的新藥奠定基礎。

A:術前; B:Sham; C:Model; D:hIGF-1 0.02 mg; E:hIGF-1 0.002 mg. Sham:假手術；Model:模型；hIGF-1：重組人胰島素樣生長因子-1.圖3 各組大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發電位波形Fig 3 The waveforms of sciatic nerve evoked potential

大鼠坐骨神經鉗夾損傷模型廣泛用于周圍神經再生與修復的實驗研究，也稱作軸索斷傷，其為非離斷性損傷，操作簡單易行，損傷程度易把握，重復性好，個體差異小，恢復快，建模后數天即可進行神經行為學指數測定[13]。神經再生室在臨床上被廣泛用于修復周圍神經損傷，其能促進內源性或外源性的神經營養物質在局部蓄積，從而發揮神經修復作用。建立坐骨神經鉗夾損傷模型時，由于鉗夾傷后神經外膜的連續性并未離斷，因此筆者認為在神經修復時局部能模擬形成神經再生室結構，hIGF-1融合蛋白能夠通過吸收性明膠海綿的彌散作用透過被膜滲入其內，在損傷組織產生濃聚作用，類似臨床上神經再生室局部給藥。

n=10. Sham:假手術；Model:模型；hIGF-1：重組人胰島素樣生長因子-1.與假手術組比較， △△:P<0.01；與模型組比較， ##:P<0.01.圖4 hIGF-1融合蛋白對鉗夾損傷大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發電位振幅的影響Fig 4 Effect of hIGF-1 fusion protein on the amplitude of compound muscle action potential in sciatic nerve injuried rats

hIGF-1：重組人胰島素樣生長因子-1. A：假手術組； B：模型組； C：hIGF-1 0.02 mg組橫切面； D：hIGF-1 0.02 mg組縱切面； E：hIGF-1 0.002 mg組橫切面； F：hIGF-1 0.002 mg組縱切面.圖5 大鼠坐骨神經染色結果(H-E ×100)Fig 5 HE staining of sciatic nerve (H-E ×100)

SFI是評價坐骨神經損傷神經再生與功能恢復的可靠方法[14]。通過對大鼠的足跡分析，筆者發現，各測定時間點模型組大鼠SFI值及SFI恢復率較假手術組顯著降低，說明鉗夾方式能有效損傷坐骨神經；而hIGF-1融合蛋白則可顯著提高模型大鼠SFI值和SFI恢復率，這提示hIGF-1融合蛋白具有促進坐骨神經損傷后神經行為功能恢復的作用。坐骨神經-腓腸肌誘發電位的檢測能夠反映神經損傷后殘余坐骨神經纖維的數量及其同步興奮程度，是一個較客觀的量化評價。當坐骨神經受到電刺激后，動作電位的振幅與其支配的腓腸肌神經纖維興奮的數量呈正相關。本研究使用hIGF-1融合蛋白35 d后大鼠坐骨神經-腓腸肌誘發電位波形較規則，振幅顯著高于模型組，表明hIGF-1融合蛋白對大鼠坐骨神經的電生理傳導功能的恢復具有促進作用。神經軸突的結構與數目是其功能的基礎，一般而言，成熟度高的神經纖維鏡下可見排列規則，致密，髓鞘較厚且完整；而成熟度低的神經纖維則直徑較細，髓鞘較薄或缺失，排列紊亂。本研究發現，hIGF-1融合蛋白對大鼠坐骨神經鉗夾損傷的結構恢復具有一定的促進作用。

綜上所述，重組hIGF-1融合蛋白對坐骨神經損傷大鼠的神經行為功能恢復、電生理傳導特性恢復及神經再生具有促進作用，為hIGF-1用于治療周圍神經損傷提供了藥效學依據。

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(編輯:張慧茹)

Effects of Recombinant Human Insulin-like Growth Factor-1on Sciatic Nerve Injury

HUANG Huihui, YANG Jian, YU Changxi

College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou350122, China

Objective To explore the therapeutic effect of hIGF-1 fusion protein on sciatic nerve crush injured rats. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: sham-operation group, model group, 0.02 mg hIGF-1 fusion protein treated group and 0.002 mg hIGF-1 fusion protein treated group. After sciatic nerve crush injury surgery, the functional evaluation of behavior, sciatic functional index(SFI), neurophysiological assessment, histomorphological assessment were performed. Results On 20thto 32thdays after surgery, the SFI and SFI recovery rate of hIGF-1 fusion protein in high and low dose groups were significantly higher than those in model group (P<0.05), and it shows a dose -dependent manner. The amplitude of compound muscle action potential in the hIGF-1 groups was statistically significantly higher than that in model group(P<0.01)on 35thday, and the effect was enhanced with the dose increasing. H-E staining showed that the count of myelinated nerve fibers in experimental group exceeded those in model group and they were thickened and complete. Conclusion hIGF-1 fusion protein can effectively promote nerve regeneration after sciaticnerve crush injury in rats．

insulin-like growth factor 1； sciatic nerve； sciatic neuropathy； rats

2017-03-14

福建省高校產學合作科技重大項目(2010Y4002); 福建省教育廳A類科技項目(JA09115)

福建醫科大學 藥學院，福州 350122

黃慧慧,女,助理實驗師，醫學碩士

俞昌喜. Email:changxiyu@mail.fjmu.edu.cn

R348； R392.11； R745.42

: A

: 1672-4194(2017)04-0207-05