短梗霉生產聚蘋果酸合成機制研究進展

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(1.齊魯工業大學食品科學與工程學院,山東濟南 250353;2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

短梗霉生產聚蘋果酸合成機制研究進展

劉濱1,2,曹偉鋒2,于海峰1,*

(1.齊魯工業大學食品科學與工程學院,山東濟南 250353;2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京 100190)

聚蘋果酸是一種可完全生物降解的高分子材料,具有高度水溶性、無免疫原性等優良特性,在生物醫藥及生物材料領域具有廣泛應用前景。文章介紹了微生物法合成聚蘋果酸的代謝途徑、關鍵酶系及其代謝調控機制,展望了聚蘋果酸合成代謝的研究方向。

聚蘋果酸,代謝途徑,關鍵酶系,代謝調控

聚蘋果酸(Poly malic acid,PMLA)是以蘋果酸為唯一單體通過酯鍵連接而成的高分子聚合物,有α型、β型和γ型三種結構形態[1](圖1),在生物體內存在的只有β-PMLA。因L-蘋果酸參與生物體內的三羧酸循環,因此β-PMLA容易在生物體內通過三羧酸循環代謝途徑除去。由于β-PMLA具有懸掛羧基,因此可通過與其它官能團、功能基團或小分子藥物反應而制得許多具有特殊功能的衍生物,如β-PMLA可通過共價鍵和非共價鍵與藥物結合,將藥物特異性靶向釋放至細胞質內[2]。由于β-PMLA具有良好的水溶性,當水不溶性藥物與其連接后,可以有效地改善藥物的水溶性。目前,β-PMLA正被開發應用于藥物載體、微膠囊材料、生物醫學材料、化妝品、食品包裝材料及表面活性劑等諸多領域[3-5]。

生物發酵法是獲得β-PMLA的主要來源,通過微生物發酵法生產的聚蘋果酸分子量高,反應條件溫和,但發酵法獲得的聚蘋果酸產量低,因此限制了β-PMLA大規模商業化應用。為實現聚蘋果酸規模化發酵生產,須對微生物代謝生成聚蘋果酸的代謝途徑有充分的認知,從而通過對特定位點的代謝調控,實現提高聚蘋果酸產量的目的。因此,本文將詳述微生物法合成聚蘋果酸的代謝途徑、關鍵酶系及其代謝調控機制,并展望聚蘋果酸合成代謝的研究方向。

圖1 PMLA的結構[1]Fig.1 Structure of polymalicacid[1]

1 β-聚蘋果酸的產生菌

β-PMLA作為酸性蛋白酶抑制劑在青霉菌(Penicilliumcyclopium)中首先發現[6],之后發現尋多頭絨泡菌(Physarumpolycephalum)[7-9]、短梗霉(Aureobasidiumspp.)[10-11]、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)[12-15]和其他黏菌及分絲孢子真菌都能合成β-PMLA。P.polycephalum分泌的β-PMLA最高濃度僅有2.7 g/L[7],且分子量范圍廣(從10～300 kDa不等)[16-17]。從不同環境中分離篩選的Aureobasidiumspp.具有合成大量的β-PMLA的能力[18],濃度可達152.5 g/L[19]。因此,Aureobasidiumspp.是有望工業化生產β-PMLA的菌株,已報道高產β-PMLA的產生菌如見表1所示。

表1 β-聚蘋果酸產生菌Table 1 β-PMLA production by different microorganisms

2 短梗霉合成β-PMLA的代謝途徑及關鍵酶系

2.1Aureobasidiumspp.合成β-PMLA的代謝途徑

合成β-PMLA代謝途徑的研究是基于L-蘋果酸是β-PMLA的前體物,通過添加代謝中間體及相關酶的抑制劑進行。

Liu等[13]發現三氟乙酸抑制β-PMLA的合成,而丙二酸、馬來酸、丁二酸和蘋果酸促進其合成,同時補充三氟乙酸與丁二酸或蘋果酸鹽能夠解除三氟乙酸的抑制作用,證明β-PMLA的合成涉及三羧酸循環途徑,異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶參與β-PMLA的合成。同時Liu等[13]依據丙二酸(琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑)對β-PMLA產生的促進作用,證明乙醛酸代謝途徑是其產生的另一途徑。靳挺等[30]通過添加代謝中間體及抑制劑的實驗,推測β-PMLA的合成主要涉及TCA循環及乙醛酸循環。程若東等[31]通過向發酵培養基中添加TCA循環的抑制劑丙二酸和順丁烯二酸及酶活分析發現A.pullulansBS24產β-PMLA的合成途徑除了TCA循環外還存在乙醛酸途徑。Zou等[32]通過補充涉及TCA循環還原途徑的外源輔助因子及CO2供體提高了β-PMLA濃度。Cao等[33]發現丙酮酸強烈抑制β-PMLA的合成,通過在β-PMLA發酵過程中添加外源的中間代謝物和酶活抑制物,證明菌株A.Pullulansipe-1合成β-PMLA的主要代謝途徑為還原途徑,即磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在PEP羧化酶催化下經由草酰乙酸合成β-PMLA。喬長晟等[34]通過代謝通量分析及關鍵酶活測定發現,丙酮酸羧化途徑及乙醛酸途徑是β-PMLA合成的主要途徑,TCA循環途徑在發酵后期代謝較弱,酶活分析證明了丙酮酸羧化途徑的加強是高產菌株比出發菌株的β-PMLA合成能力強的主要原因。綜合目前對A.pullulans合成β-PMLA研究成果,可將A.pullulans利用葡萄糖生成聚蘋果酸的途徑歸納為三條,即:草酰乙酸還原反應,TCA循環,乙醛酸循環(如圖2所示)。

圖2 β-聚蘋果酸合成路徑Fig.2 Pathways for β-PMLA biosynthesis

2.2Aureobasidiumspp.合成β-PMLA的關鍵酶系及基因

3 Aureobasidium spp.合成β-PMLA的代謝調控

大多遺傳系統發育分支的Aureobasidiumspp.能夠大量合成β-PMLA[41],產量從9.8 g/L[12]到152.5 g/L[19]不等。因此,Aureobasidiumspp.在β-PMLA工業化生產中具有極大的潛力,通過對Aureobasidiumspp.合成β-PMLA的代謝過程調控,以達到提高β-PMLA產量的目的。目前出芽短梗霉發酵合成聚蘋果酸的調控研究主要集中在培養基優化和發酵過程的調控。

3.1Aureobasidiumspp.合成β-PMLA培養基優化

3.1.1 碳源、氮源的影響Aureobasidiumspp.發酵合成聚蘋果酸時,可利用的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、麥芽糖等,此外,一些生物質也被用于聚蘋果酸的發酵生產。Zan等[29]以生甘薯為原料,將甘薯經均質、酸解、液化、糖化處理作為碳源,通過有氧纖維素床生物反應器(AFBB)發酵,β-PMLA的產量可達57.5 g/L。Timothy等[26]對比了經預堿性H2O2處理的玉米秸稈和小麥秸稈對出芽短梗霉發酵生產聚蘋果酸的影響,結果表明,經過預處理的小麥秸稈的發酵性能優于玉米秸稈,A.pullulansNRRL 50383在含有5%小麥秸稈,3% CaCO3培養基中可產生23.5 g/L的β-PMLA。Zhou等[27]考察了用玉米芯粉作為碳源對A.pullulanYJ 6-11產聚蘋果酸的影響,玉米芯水解液中糖類主要包含木糖、葡萄糖和少量的阿拉伯糖,結果發現用玉米芯水解液發酵產生聚蘋果酸的產量與用木糖和葡萄糖混合發酵時聚蘋果酸產量相近。Wang等[19]采用玉米漿與葡萄糖混合發酵,經10L發酵罐發酵,最終獲得152.52 g/L的Ca2+-PMLA。Amartey等[42]報道玉米漿中含有豐富的營養元素,包括生物素、氨基酸、礦物質和其他營養元素,玉米漿中所含有的生物素激活了丙酮酸羧化酶的活性,提高了β-PMLA的產量。玉米漿還可以提供氮源,氨基酸等滿足細胞生長代謝所需的營養成分。Cheng等[22]報道了采用大豆制品加工的副產物大豆皮和大豆糖蜜發酵生產聚蘋果酸,大豆糖蜜可無需經過酶解預處理步驟而直接被A.pullulansZX-10利用,原因是A.pullulans中含有編碼α-半乳糖苷酶和β-呋喃糖苷酶的基因并能表達,從而使A.pullulans直接分解利用大豆低聚糖。Wei等[23]研究了甘蔗糖蜜對發酵產生β-PMLA的影響,結果發現采用甘蔗糖蜜發酵時無需添加額外氮源即可滿足發酵需要,補加氮源反而會抑制β-PMLA的生成。

當培養基中含有高濃度的氮源時,聚蘋果酸的合成受到抑制[19]。Knuf等[43]發現,在氮限制的發酵培養基中,Aspergillusoryzae胞內大部分的糖酵解基因和與胞質L-蘋果酸生產途徑相關的所有基因的表達都高度上調。R?dkr等[44]認為在氮限制條件下,許多鋅指蛋白如Msn2/4、Gat1、Gln3和AreA參與了有機酸、胞外多糖、抗生素等的合成。殷海松等[45]報道了氨基酸對出芽短梗霉發酵生產聚蘋果酸的影響,發現隨著氨基酸添加量的增加,β-PMLA的產量先增加后減小,天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸和蘇氨酸對出芽短梗霉生長和β-PMLA合成最有利。天冬氨酸對產物的合成影響最明顯,原因可能是因為其通過轉氨作用形成草酰乙酸,草酰乙酸再還原為蘋果酸最終合成β-PMLA。王麗燕等[46]考察了NaNO3、蛋白胨、尿素、NH4Cl,丁二酸銨、(NH4)2SO4對β-PMLA產量的影響,結果發現,丁二酸銨作為氮源時β-PMLA的產量最高。Wang等[47]研究了不同濃度的NH4NO3對細胞的生長和β-PMLA產量的影響。發現在最低濃度(0.1 g/L)時在發酵前期無法滿足細胞生長。在最高濃度(10 g/L),細胞生長迅速,但發酵結束時仍有未被消耗的過量的氮源不利于β-PMLA的生成。當在氮限制條件下(2 g/L)時,β-PMLA產量最高。在發酵36 h后消耗完畢,發酵前期適量的氮源維持細胞生長,在發酵后期低濃度的氮有利于β-PMLA的合成。在氮限制條件下,參與聚蘋果酸合成(GLK、CS、FUM、DAT、MCL)和TOR信號通路(GS、TOR1、Tap42、Gat1)相關的基因表達水平明顯上調。在整個發酵過程中,細胞內ATP/ADP的整體水平都高于氮飽和條件,更高水平的ATP可以提供聚合形成β-PMLA所需的能量。

Tu等[52]研究了吐溫80對β-PMLA發酵的影響,結果表明培養基中添加0.05%吐溫80,β-PMLA產量與對照組相比增加了75.08%。其原因是吐溫80在發酵前期能夠調控和增加氧吸收速率和二氧化碳釋放速率,改變細胞的形態有利于細胞與底物接觸。同時還發現線粒體二羧酸轉運蛋白和跨膜轉運蛋白的轉錄水平顯著上調。

3.2Aureobasidiumspp.合成β-PMLA發酵過程調控

3.2.1 溶氧、pH及氧化還原電位的影響 Cao等[24]研究了溶氧與轉速對A.pullulansipe-1發酵的影響,認為發酵過程分為三個階段,第一階段,在高溶氧(DO>70%)下使細胞大量生長,此階段轉速維持在800 r/min。第二階段,通過自動調節轉速,使溶氧維持在70%以促進菌體大量合成β-PMLA。第三階段通過采用低轉速控制細胞的生長,將溶氧維持在70%以提高β-PMLA產量。此外研究還發現在發酵后期缺乏還原力是β-PMLA合成效率降低的因素之一,控制發酵過程氧化還原電位(ORP)低于70 mV,β-PMLA的產量提高15.6%。Xia等[53]報道采用分階段溶氧控制策略能同時提高β-PMLA和普魯蘭多糖的產量。第一階段,將溶氧控制在30%以提高普魯蘭多糖的產量,在發酵72 h之后,將溶氧提高到70%以促進β-PMLA的積累,經過兩個階段的發酵過程,最終獲得118.6 g/L的β-PMLA和27.2 g/L普魯蘭多糖。

控制pH6.0及溶解氧濃度大于70%,能顯著促進A.pullulans酵母形態細胞的比例,并提高β-PMLA的濃度[15]。發酵48 h后,合成的β-PMLA分子量開始下降[33],說明合成的高分子量β-PMLA被降解或者新合成的β-PMLA分子量較小,可能原因是在該階段β-PMLA降解酶的活力增強,致使高分子量β-PMLA發生降解。發酵培養基在低pH條件下(pH<5),會造成β-PMLA水解,多糖含量的增加。在pH為3的條件下,A. pullulans會形成厚垣孢子,抑制β-PMLA的產生[54]。

3.2.2 代謝抑制物及中間體的調控 Liu等[13]報道外源三氟乙酸抑制β-PMLA的生成,當培養基中添加琥珀酸鹽或蘋果酸鹽時,這種抑制作用被解除。程若東等[31]報道培養基中添加不同濃度的富馬酸和L-蘋果酸對菌體生長影響不大,但都可明顯促進β-PMLA的累積。通過調節代謝流在TCA循環和乙醛酸途徑之間的分布,調節代謝中間體的量,可促使菌株能夠高效地利用碳源合成β-PMLA。Zou等[32]發現通過補充TCA還原途徑中的輔助因子生物素及CO2供體提高了β-PMLA濃度。Cao等[33]發現添加外源丙酮酸抑制了β-PMLA的合成及細胞的生長。

4 展望

目前,關于β-PMLA的生物合成途徑的報道主要是基于其單體L-蘋果酸的合成途徑分析的,涉及了L-蘋果酸生物合成的所有已知途徑,但對β-PMLA合成的關鍵途徑和酶尚沒有一致的結論。Wittmann-Liebold等[55]和B?hmer等[56]報道蛋白質組學可以定性和定量測量大量直接影響細胞的形態學和生物化學過程的蛋白質,從而準確提供細胞生長、分化以及響應環境因素過程中的蛋白質狀態變化的分析。然而Aureobasidiumspp.合成β-PMLA關鍵基因還存在爭議,因此合成β-PMLA的關鍵蛋白質與關鍵基因還有待進一步深入研究,而采用蛋白質組學技術篩選并分析β-PMLA合成相關差異蛋白質,進而采用合成生物學手段構建調控關鍵蛋白質基因的工程菌,為研究β-PMLA的合成途徑提供了另一思路。

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ResearchadvancesonmetabolismandregulationofpolymalicacidproductionbystrainsofAureobasidiumspp.

LIUBin1,2,CAOWei-feng2,YUHai-feng1，*

(1.College of Food Science and Engineering,Qilu University of Technology,Jinan 250353,China;2.State Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)

Poly(malic acid)is a fully biodegradable polymer material with advantages of high water-solubility,biodegradability and non-immunogenicity,which has wide application prospects in biomedicine and biomaterials industries.The metabolic pathway,the key enzyme systemsand the regulation metabolismin the biosynthesis of polymalic acid were summarized in this review. And the research tendency of poly-malic acid biosynthesis metabolism was also proposed.

polymalic acid;metabolic pathway;key enzyme system;metabolic regulation

2017-03-03

劉濱(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail:liubin761@163.com。

*通訊作者:于海峰(1975-)，女，博士，教授， 研究方向：食品生物技術，E-mail:yhfdzz@126.com。

國家自然科學基金資助項目(21406240)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0347-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.067