葉黃素與玉米黃質協同抗氧化活性的研究

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(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023;2.大連醫諾生物有限公司,遼寧大連 116600)

葉黃素與玉米黃質協同抗氧化活性的研究

任丹丹1,2,張海麗1,王惜童1,薛凌云2,吳文忠2

(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023;2.大連醫諾生物有限公司,遼寧大連 116600)

葉黃素和玉米黃質是人類眼睛中主要的類胡蘿卜素,它們對預防眼部疾病具有重要作用。本文通過研究不同比例的葉黃素和玉米黃質在體內和體外的抗氧化活性,探討其協同抗氧化活性,為復合類胡蘿卜素產品的開發提供理論依據。通過DPPH自由基清除體系、FRAP法和ORAC法三種方法探討了葉黃素和玉米黃質之間的體外協同抗氧化活性。通過建立ICR小鼠體內乙醇氧化損傷模型,考察葉黃素和玉米黃質在體內的協同抗氧化活性。結果表明:葉黃素與玉米黃質以1∶2比例存在時體外協同抗氧化效果最佳,2∶1效果較差。葉黃素/玉米黃質(1∶2)組在各個指標上顯示出更強的體內抗氧化活性。

葉黃素,玉米黃質,協同抗氧化

類胡蘿卜素是一類具有多個共軛雙鍵的萜烯基團的化合物,迄今已發現了700多種類胡蘿卜素。流行病學調查,動物體內實驗及細胞實驗結果均表明,類胡蘿卜素具有較強抗癌、抗輻射和預防心血管疾病等作用[1]。類胡蘿卜素的這些保護作用都直接或間接地與其抗氧化作用有關。有些類胡蘿卜素在人體組織器官中發揮重要作用,如葉黃素和玉米黃質是視網膜黃斑的組成成分。臨床研究發現攝入葉黃素可以提高黃斑的色素含量,而且能夠提高老年性黃斑衰退癥(AMD)病人的視力[2],由于葉黃素能夠清除自由基并且能夠吸收藍光,進而可以預防白內障和防止對眼睛的損傷,而葉黃素與玉米黃質以適宜的比例存在，對視力的保護效果更好[3-4]。因此,研究葉黃素與玉米黃質的協同抗氧化效果對更進一步深入研究葉黃素與玉米黃質對視網膜的保護作用具有重要意義。本文將從體內外兩個方面,研究不同比例葉黃素和玉米黃質產品的協同抗氧化活性,旨在為類胡蘿卜素產品的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

葉黃素 冷水可溶(Cold water soluble,簡稱CWS)；CWS5%微囊粉,玉米黃質CWS5%微囊粉,維生素E 大連醫諾生物有限公司;SPF級雄性ICR小鼠 體質量18～22 g,80只,大連醫科大學實驗動物中心;BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、蛋白質羰基(POC)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;實驗所用各種試劑及藥品 國產分析純。

FE20 pH計、AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;SynergyH1酶標儀 美國博騰儀器有限公司;SHA-BA水浴恒溫振蕩器 金壇市順華儀器有限公司;CR22G 型高速冷凍離心機 日立公司;低溫高速離心機 Thermo Fisher公司;HH-4型顯數恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;PE Lambda25紫外可見分光光度計 PerkinElmer Co.。

1.2實驗方法

1.2.1 類胡蘿卜素對DPPH自由基的清除作用 參照熊雙麗和惲祥慧[5-10]等報道的方法,稍加改動后應用于96孔板中。依次在酶標板的每孔中加入40 μL不同濃度維生素E或樣品液和160 μL 0.12 mmol/L的DPPH乙醇溶液。在25 ℃條件下反應30 min后,在517 nm下用酶標儀測定其吸光度。采用樣品溶劑代替樣品作為對照組,無水乙醇替代DPPH溶液作為樣品空白組。樣品清除率計算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式中:A0,A1,A2分別代表對照(不加樣)、樣品和樣品空白(不加DPPH)測出的吸光度。

1.2.2 類胡蘿卜素對鐵離子的還原能力(FRAP) 參照Benzie和惲祥慧[6,11-13]等報道的方法,稍加改動后應用于96孔板中進行實驗,即新鮮配制150 μL 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)工作液與5 μL不同濃度FeSO4(0.1～1.6 mmol/L)的標準溶液混合于96孔板中,以蒸餾水作為空白對照,將96孔板置于酶標儀中振搖1 min后,在37 ℃下溫育40 min,593 nm處測定其吸光度并繪制濃度與吸光度的標準曲線。以類胡蘿卜素樣品溶液代替FeSO4標準溶液即可測得樣品吸光度值的變化,然后在標準曲線上求得FRAP值。樣品的鐵離子還原能力(FRAP值)以達到相同吸光度所需FeSO4的毫摩爾數表示。

1.2.3 類胡蘿卜素的氧自由基吸收能力(ORAC) 參照李紅艷和王曉宇[14-19]等報道的方法并稍加改動進行實驗。在96孔板中依次加入25μL不同濃度的標準抗氧化劑(Trolox)溶液和150 μL熒光素鈉鹽溶液(0.0861 nmol/L),然后將96孔板放入熒光酶標儀中,用gene5軟件編程操作,37 ℃預熱10 min后,迅速加入AAPH溶液25 μL(153 mmol/L),持續振蕩,在激發波長485 nm,發射波長538 nm下用熒光酶標儀測定。初始熒光強度值記為F0,每2 min測定一次各孔熒光強度(Fn),熒光衰減呈基線后停止(本實驗與設定時間為2.5 h)。設定空白對照,即用緩沖液代替抗氧化劑作為對照(+AAPH)。

通過gene5軟件將實驗所得各微孔反應的熒光強度數據輸出到Excel表格中進一步處理。各微孔不同時間點的絕對熒光強度數據與初始熒光強度(F0)的比值即為相對熒光強度fi;再根據以下公式計算衰減曲線下的面積及保護面積(NetAUC),以Trolox濃度為橫坐標,保護面積NetAUC為縱坐標繪制標準曲線。

AUC=2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn

注:初始相對熒光強度即為f0,每隔2 min測定一次,相對熒光強度分別記為f0,f2…fn。

保護面積NetAUC=AUC抗氧化劑-AUC+AAPH

按照Trolox標準曲線的繪制中所述方法,以類胡蘿卜素產品代替Trolox標準抗氧化劑溶液,測定一定濃度下保護面積。將樣品在自由基作用下熒光衰退曲線的延緩部分面積(NetAUC)代入標準抗氧化物質Trolox的NetAUC與Trolox濃度所繪制的標準曲線,得出與各樣品濃度的氧自由基清除能力等價的Trolox濃度,再轉換成以μmol Trolox當量/g類胡蘿卜素表示(μmol Trolox/g)即ORAC值。

1.2.4 類胡蘿卜素對乙醇氧化損傷模型小鼠抗氧化作用 將70只雄性ICR小鼠隨機分為7組,每組10只。分別為空白對照組,模型對照組,陽性對照組(天然VE),葉黃素CWS微囊粉、玉米黃質微囊粉、葉黃素與玉米黃質不同比例混合組,各組均用0.5% CMC-Na溶解。分組與劑量見表1。各組動物適應性喂養3 d后以基礎飼料喂養,樣品組每天分別灌胃不同劑型葉黃素產品和玉米黃質受試樣品,連續灌胃30 d。末次灌胃后,模型對照組和各樣品劑量組一次性灌胃50%乙醇12 mL/kg·BW,空白對照組灌胃等量蒸餾水,6 h后小鼠摘眼球取血,收集血液,頸椎脫臼處死小鼠。

表1 分組與劑量Table 1 The group and dosage

將小鼠血液在3500 r/min,4 ℃下離心10 min,取血清,用試劑盒測定血清中GSH、MDA含量以及GSH-PX、SOD活力。取肝右葉組織制成10% 肝組織勻漿,用試劑盒測定GSH、SOD、GSH-Px、MDA和蛋白質羰基各指標。

1.3數據處理

2 結果與分析

2.1對體外DPPH·清除效果比較

葉黃素與玉米黃質產品之間協同對DPPH·清除效果如表2所示。

表2 不同比例的葉黃素與玉米黃質組合對DPPH·清除效果Table 2 The scavenging DPPH· activity of lutein and zeaxanthin with different combination

注:通過LSD和Student-Newma-Keuls法進行多重比較,同列上標不同小寫字母表示有顯著差異(p<0.05),未標明字母表示組間無顯著性差異(p>0.05)。表3、表4同。

表3 不同比例的葉黃素與玉米黃質組合對鐵離子的還原能力Table 3 The ferric reducing ability of lutein and zeaxanthin with different combination

表4 不同比例的葉黃素與玉米黃質組合ORAC值Table 4 The ORAC value of lutein and zeaxanthin with different combination

從表2中可看出,當葉黃素與玉米黃質分別以5∶1、4∶1、2∶1、1∶1和1∶2的比例組合存在時,均具有DPPH自由基清除能力。各組產品對DPPH自由基的清除效果隨著濃度增加而增大。在同一水平濃度下,葉黃素與玉米黃質混合組的清除效果優于其單一產品的清除效果。綜合不同比例及不同濃度的清除效果,葉黃素與玉米黃質產品以1∶2比例存在時,其DPPH·清除效果最佳,1∶1次之,2∶1較差。

2.2對鐵離子還原能力比較

葉黃素與玉米黃質產品協同對鐵離子還原能力的結果如表3所示。

從表3中可看出,當葉黃素與玉米黃質以不同比例混合時,均具有對鐵離子還原的能力。各組產品對鐵離子還原能力隨濃度增加而增大,且混合組對鐵離子還原能力優于其以單一產品。綜合不同比例及不同濃度樣品對鐵離子還原效果,葉黃素與玉米黃質產品以1∶1比例存在時對鐵離子還原能力最佳,1∶2次之,4∶1和5∶1較差。

2.3對氧自由基吸收能力的比較

葉黃素與玉米黃質產品協同對氧自由基吸收能力的結果如表4所示。

從表4中可看出,單一產品葉黃素與玉米黃質以及混合產品均具有較強的氧自由基吸收能力,但玉米黃質的氧自由基吸收能力明顯高于葉黃素產品(p<0.05)。各混合比例組中,1∶2、4∶1與5∶1組的效果顯著優于葉黃素產品(p<0.05),而這三組與玉米黃質相比,僅有1∶2組的效果具有顯著性差異(p<0.05)。綜合比較,葉黃素與玉米黃質產品以1∶2比例組合時,其ORAC值較高;而1∶1和2∶1組合的效果相對較差。

綜合以上葉黃素與玉米黃質體外抗氧化的實驗結果,在后續實驗中,選用協同效果較好的1∶2組合,以及協同效果較差的2∶1組合進行動物體內實驗。

2.4葉黃素和玉米黃質對ICR小鼠血清抗氧化水平的影響

葉黃素和玉米黃質對小鼠血清中各指標的影響見表5。

表5 各組產品對小鼠血清SOD、GSH、GSH-Px和MDA的影響Table 5 Effects of different carotenoids group on SOD、GSH、GSH-Px and MDA in mice serum(±S,n=10)

注:與空白對照組相比,a為差異顯著(p<0.05),b為差異極顯著(p<0.01);與模型對照組相比,A為差異顯著(p<0.05),B為差異極顯著(p<0.01)。表6同。

表6 各組產品對小鼠肝組織SOD、GSH、GSH-Px、MDA和PCO的影響Table 6 Effects of different groups on SOD、GSH、GSH-Px、MDA and PCO in mice liver tissue(±S,n=10)

從表5可看出,給予實驗劑量(50%乙醇12 mL/kg·BW)乙醇造模,模型對照組與空白對照組相比,小鼠血清SOD和GSH-Px活性下降且差異極顯著(p<0.01),GSH含量降低、MDA含量升高且差異極顯著(p<0.01),由此說明乙醇氧化損傷模型造模成功。與模型組相比,各實驗組均能顯著降低小鼠血清MDA含量(p<0.01),增加GSH水平(p<0.01),同時還能增加小鼠體內的GSH-Px酶活(p<0.01)和SOD酶活(p<0.01),說明葉黃素、玉米黃質以及葉黃素與玉米黃質混合樣品對乙醇氧化損傷ICR小鼠有較好的抗氧化作用。在葉黃素與玉米黃質混合組中,葉黃素/玉米黃質(1∶2)組顯示出比葉黃素/玉米黃質(2∶1)更優越的抗氧化性能。

2.5葉黃素與玉米黃質產品對ICR小鼠肝臟抗氧化水平的影響

各組產品對ICR小鼠肝臟抗氧化水平的影響,如表6所示。

給予實驗劑量(50%乙醇12 mL/kg·BW)乙醇造模,模型對照組與空白對照組相比,結果發現小鼠肝臟組織SOD和GSH-Px活性下降且差異極顯著(p<0.01),GSH含量降低且差異顯著(p<0.05),MDA和蛋白質羰基含量升高且差異極顯著(p<0.01)。與模型組相比,各實驗組均能降低小鼠組織MDA和PCO含量(p<0.01),增加GSH水平(p<0.01),同時還能夠增加小鼠體內的GSH-Px酶活(p<0.05)和SOD酶活(p<0.01),表現出較好的體內抗氧化活性。在葉黃素與玉米黃質混合組中,葉黃素/玉米黃質1∶2組的抗氧化效果較好,優于單一形式存在的產品以及葉黃素/玉米黃質2∶1組,這與之前的體外抗氧化活性實驗結果一致。

3 結論與討論

視網膜內除含有很多對光敏感的化合物外,還含有如DHA等的易氧化底物。視網膜上的光敏物質在有光照刺激的情況下會發生氧化反應,生成對視網膜色素上皮細胞有毒性的物質,而該物質是老年性黃斑變性發生的主要因素之一。另外,視網膜內還分布著大量的毛細血管,這使得其氧濃度很高。晶狀體聚焦可產生高強度、高能量的光線,而光線很容易在視網膜中誘發能與含雙鍵分子(如DHA)發生反應的單線態氧自由基,二者發生后會進一步引發能使視網膜受到氧化損傷的脂質過氧化鏈式反應[20-21]。葉黃素和玉米黃質是視網膜黃斑的組成成分[22]。

葉黃素與玉米黃質在結構上互為同分異構體,差別僅為其中一個紫羅酮環的雙鍵位置不同。葉黃素的這個雙鍵形成烯丙基羥基末端,而玉米黃質中相應的雙鍵則與相鄰直鏈雙鍵形成共軛體系。在抗氧化活性方面,兩者在不同的抗氧化指標中效果有所不同,這可能與兩者的活性基團及雙鍵位置在氧化過程中所起到的作用不同有關。不同比例進行混合后,仍然呈現出不同的抗氧化效果,說明葉黃素與玉米黃質的抗氧化協同作用與其配比關系較大。本文研究了葉黃素與玉米黃質不同比例混合樣品的體內外抗氧化效果。研究發現:葉黃素與玉米黃質以1∶2比例能發揮較好的協同抗氧化作用,對DPPH自由基的清除能力、鐵離子還原能力及氧自由基吸收能力較高。在體內實驗中,葉黃素/玉米黃質1∶2組體現出較好的抗氧化效果。該項研究結果為日后更進一步深入研究葉黃素與玉米黃質對視網膜的保護作用具有重要意義。

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Studyonthesynergisticantioxidantactivityofluteinandzeaxanthin

RENDan-dan1,2,ZHANGHai-li1,WANGXi-tong1,XUELing-yun2,WUWen-zhong2

(1.College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2. Dalian Innobioactives Company Limited,Dalian 116600,China)

Lutein and zeaxanthin are major carotenoids in human eyes. They have very good effects to prevent eye disease. In this paper,antioxidant activity of lutein and zeaxanthininvivoandinvitrowere discussed,which provided a theoretical basis for the development of composite carotenoids products. Antioxidant activities of lutein and zeaxanthininvitrowere measured by methods including DPPH radical scavenging system,FRAP and ORAC. Synergistic antioxidant activities of lutein and zeaxanthininvivowere studied by the establishment of ethanol oxidation damage model using ICR mice. The results showed that the ratio of lutein and zeaxanthin 1∶2 had excellent antioxidant effectinvitro,while 2∶1 had poor effect. Group of lutein/zeaxanthin 1∶2 showed stronger antioxidant activitiesinvivo.

lutein;zeaxanthin;synergistic antioxidant

2017-02-20

任丹丹(1980-),女,博士,副教授,研究方向:海洋生物資源利用,E-mail:rdd80@163.com。

大連市企業博士后研究人員資助項目。

TS254.2

:A

:1002-0306(2017)17-0296-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.058