毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制研究

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(華北理工大學(xué)藥學(xué)院,河北唐山 063000)

毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制研究

于德紅,王美,陳金銘,王旭,耿增巖,李穎

(華北理工大學(xué)藥學(xué)院,河北唐山 063000)

目的:研究毛蕊異黃酮對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及作用機(jī)制。方法:小鼠皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1,連續(xù)6周,造模后的小鼠分為模型組、奧拉西坦組(300 mg·kg-1·d-1)、和毛蕊異黃酮高、中、低劑量組(20、12、7 mg·kg-1·d-1)。模型組和正常對(duì)照組小鼠給予等劑量的生理鹽水。處理7 d后,利用跳臺(tái)和Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空間記憶和被動(dòng)學(xué)習(xí)能力,測(cè)定肝、脾、胸腺和腦器官指數(shù),檢測(cè)血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量和腦組織中乙酰膽堿酯酶(AchE)活力。結(jié)果表明,與模型組相比,毛蕊異黃酮處理組小鼠在Y迷宮中正確反應(yīng)次數(shù)和主動(dòng)回避率明顯增加(p<0.05),在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中逃避期均明顯縮短,錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(p<0.05);毛蕊異黃酮處理組小鼠肝、脾、胸腺和腦器官指數(shù)與正常對(duì)照組沒(méi)有明顯差異;抗氧化酶(T-SOD、GSH-Px)活力顯著升高(p<0.05),MDA含量明顯降低,腦組織中AchE活性降低(p<0.05)。結(jié)論:毛蕊異黃酮對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用,毛蕊異黃酮可能是通過(guò)提高內(nèi)源抗氧化酶(T-SOD、GSH-Px)活力,降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,保護(hù)腦、脾、胸腺等器官功能和降低腦組織AchE活性來(lái)提高D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

毛蕊異黃酮,D-半乳糖,器官指數(shù),抗氧化,抗衰老

隨著世界人口老齡化進(jìn)程的不斷加速,衰老及其相關(guān)疾病已成為當(dāng)今日益嚴(yán)重的社會(huì)和醫(yī)療問(wèn)題,抗衰老研究也已成為當(dāng)前科研領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問(wèn)題[1-3]。毛蕊異黃酮(Calycosin)是植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge)和蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge. var. mongholicus)的主要活性成分之一,也是紫穗槐(AmorphafruticosaL.)、紅車(chē)軸草(TrifoliumpratenseL.)、黃甘草(GlycyrrhizaeurycarpaP. C. Li)等豆科植物中含有的主要活性成分。毛蕊異黃酮為白色針狀結(jié)晶,弱極性,熔點(diǎn)226～228 ℃[4-6]。作為典型的植物雌激素,毛蕊異黃酮能夠與機(jī)體的雌激素受體結(jié)合,產(chǎn)生雌激素樣作用,具有抗氧化、抗過(guò)敏、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面的藥理作用[7-8]。目前已有研究表明毛蕊異黃酮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[9-11],為進(jìn)一步研究毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,本研究建立D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型[12-13],考察毛蕊異黃酮對(duì)小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力的影響,檢測(cè)其對(duì)器官指數(shù)和T-SOD、GSH-Px、AchE等酶活力的影響,初步探討毛蕊異黃酮對(duì)小鼠改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

健康7周齡雄性昆明小鼠65只,平均體重為(27.71±0.41) g,由華北理工大學(xué)動(dòng)物中心提供,許可格證號(hào):SYXK(冀)2010-0038。

毛蕊異黃酮實(shí)驗(yàn)室自制(純度98%以上)[14];D-半乳糖 上海試劑二廠出品(批號(hào):120809);0.9%生理鹽水 河北天成藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):C11082501);奧拉西坦注射液 廣東世信藥業(yè)有限公司出品(批號(hào):1202015);肝素鈉、T-SOD試劑盒、MDA試劑盒、AchE 測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

YLS-3TB型跳臺(tái)記錄儀 淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;MG-3s型迷宮刺激器 淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;KDC-16H高速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普斯通用儀器有限責(zé)任公司;Sunrise全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 將65只昆明小鼠分組喂養(yǎng),隨機(jī)分出10只為對(duì)照組,其余小鼠皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1,對(duì)照組每天注射等體積生理鹽水,連續(xù)注射42 d[13-14]。42 d后,在末次注射第2 d對(duì)小鼠進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn),測(cè)定并記錄跳上橡皮墊的逃避期、第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內(nèi)受電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后重復(fù)第1 d的實(shí)驗(yàn)操作并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為記憶成績(jī)。與對(duì)照組比較,其他組小鼠跳上橡皮墊的逃避期明顯延長(zhǎng),行動(dòng)遲緩,喜蜷縮,毛發(fā)枯黃無(wú)光澤,第一次跳下橡皮墊的潛伏期縮短,5 min內(nèi)受電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))明顯增加。對(duì)注射D-半乳糖造模的動(dòng)物進(jìn)行篩選,剔除學(xué)習(xí)成績(jī)有顯著性差異的小鼠,選取潛伏期<45 s的小鼠,對(duì)其進(jìn)行分組,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行認(rèn)知檢驗(yàn),將造模成功的小鼠分為:陽(yáng)性藥物組、模型組、毛蕊異黃酮高劑量組,中劑量組和低劑量組,每組10只。陽(yáng)性藥物組給予奧拉西坦(Oxiracetam)(300 mg·kg-1·d-1),毛蕊異黃酮高(H)、中(M)、低(L)劑量組分別腹腔注射給予20、12、7 mg·kg-1·d-1的毛蕊異黃酮藥物,模型組、對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.3 Y-型迷宮檢測(cè) 6組小鼠分別腹腔注射給予相應(yīng)的藥物,給藥第7 d后進(jìn)行Y-迷宮實(shí)驗(yàn),每天每鼠訓(xùn)練10次,連續(xù)訓(xùn)練2 d后,第3 d測(cè)定其學(xué)習(xí)記憶能力,記錄每組小鼠正確反應(yīng)次數(shù),錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)及各自的潛伏期[15]。測(cè)定并記錄小鼠在10次測(cè)定中的錯(cuò)誤次數(shù)、被動(dòng)回避次數(shù)及所用時(shí)間、主動(dòng)回避次數(shù)及所用的時(shí)間。

1.2.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 給藥第7 d后測(cè)定并記錄跳上橡皮墊的逃避期、第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內(nèi)受電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后重復(fù)第1 d的實(shí)驗(yàn)操作并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為記憶成績(jī)。

1.2.5 小鼠血清AchE、T-SOD、GSH-Px和MDA測(cè)定 1.2.3、1.2.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠眼眶取血,置于內(nèi)有肝素鈉的塑料離心管中,4 ℃,12000 r/min離心10 min,分離血清,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定T-SOD活力、GSH-Px、以及MDA含量。

1.2.6 小鼠腦組織中AchE活性測(cè)定及器官指數(shù)檢測(cè) 對(duì)給藥7 d后的小鼠進(jìn)行稱(chēng)重,再解剖分離每只小鼠的大腦、脾臟、肝臟和胸腺,吸除血跡后進(jìn)行稱(chēng)重,分別計(jì)算器官指數(shù)=器官質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)。取腦組織,加入 0.9%預(yù)冷生理鹽水,制成 10%腦組織勻漿,以 3500 r/min 離心 10 min,取上清液比色法檢測(cè)腦中 AchE活性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)為至少3次的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.),采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行組間比較單因素方差分析,p<0.05為差異有顯著性,p<0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1毛蕊異黃酮對(duì)小鼠空間記憶能力影響

Y-型迷宮主要釆用燈光和電刺激,使大鼠形成回避條件反射,通過(guò)觀察回避條件反射和空間辨別能力來(lái)判斷小鼠空間記憶能力[15]。如表1所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠對(duì)刺激的正確反應(yīng)率和主動(dòng)回避率明顯降低,正確和錯(cuò)誤的反應(yīng)潛伏期明顯延長(zhǎng)(p<0.05),表明模型小鼠空間記憶能力下降。與模型組相比,毛蕊異黃酮高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠正確反應(yīng)次數(shù)和主動(dòng)回避率明顯增加,正確反應(yīng)潛伏期以及錯(cuò)誤反應(yīng)潛伏期時(shí)間均縮短,差異均具有顯著性(p<0.05)。表明毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠空間記憶能力具有促進(jìn)作用。

表1 毛蕊異黃酮對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠Y-迷宮實(shí)驗(yàn)行為的影響Table 1 Effects of calycosin on the Y-maze test in aged mice induced by D-galactose(±S,n=10)

注:與對(duì)照組相比* p<0.05,** p<0.01;與模型組相比# p<0.05,## p<0.01,表2～表4,圖1同。

表2 毛蕊異黃酮對(duì)小鼠跳臺(tái)成績(jī)的影響Table 2 Effects of calycosin in step-down test for mice(±S,n=10)

表3 毛蕊異黃酮對(duì)小鼠的腦、脾、肝和胸腺指數(shù)的影響Table 3 Effects of calycosin on indexes of brain,spleen,liver,and thymus of mice(±S,n=10)

2.2毛蕊異黃酮對(duì)小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力影響

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)屬于被動(dòng)回避性條件反射,經(jīng)常用來(lái)測(cè)試小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力[16]。如表2所示,與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠跳到平臺(tái)上的逃避期延長(zhǎng),潛伏期縮短,受到電擊的錯(cuò)誤次數(shù)增多,表明模型小鼠的被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力降低(p<0.05)。與模型組相比,毛蕊異黃酮高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠逃避期均明顯縮短,被電擊的錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少,潛伏期明顯延長(zhǎng),且差異均具有顯著性(p<0.05),毛蕊異黃酮高劑量組效果要好于奧拉西坦組。表明毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶有明顯改善作用。

2.3毛蕊異黃酮對(duì)模型小鼠腦、脾、肝臟和胸腺指數(shù)的影響

如表3,與對(duì)照組相比,模型組小鼠腦指數(shù)明顯降低,表明腦組織萎縮變小(p<0.05),與模型組小鼠相比,毛蕊異黃酮高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠腦組織重量明顯增加,且差異具有顯著性(p<0.05)。與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝脾指數(shù)升高,表明肝脾出現(xiàn)了代償性增生(p<0.05),與模型組小鼠相比,毛蕊異黃酮高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)明顯降低,差異具有顯著性(p<0.05),且趨于對(duì)照組,表明毛蕊異黃酮能保護(hù)肝脾免受損傷,使肝脾機(jī)能趨于正常。長(zhǎng)期注射D-半乳糖會(huì)導(dǎo)致模型小鼠胸腺指數(shù)明顯下降[17],毛蕊異黃酮和奧拉西坦均可以增高胸腺指數(shù),提高機(jī)體免疫機(jī)能。以上結(jié)果表明毛蕊異黃酮對(duì)小鼠腦、肝、脾、胸腺等器官具有一定的保護(hù)作用,且呈劑量依賴(lài)性。

2.4毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠血清T-SOD、GSH-Px和MDA的影響

如表4所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中T-SOD和GSH-Px活性明顯降低(p<0.05),MDA含量明顯提高(p<0.05),表明D-半乳糖致衰老小鼠存在著嚴(yán)重的抗氧化系統(tǒng)和脂質(zhì)過(guò)氧化異常[17]。與模型組相比,毛蕊異黃酮高、中、低劑量組小鼠血清中T-SOD活力和GSH-Px活力顯著升高,而MDA含量顯著降低(p<0.01),且毛蕊異黃酮高劑量組的效果優(yōu)于奧拉西坦。以上結(jié)果表明,毛蕊異黃酮可降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度,減輕自由基對(duì)組織局部的損害和保護(hù)組織,顯著增強(qiáng)D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化能力。

表4 毛蕊異黃酮對(duì)小鼠血清T-SOD、GSH-Px、MDA的影響Table 4 Effects of calycosin on T-SOD,GSH-Px and MDA in serum of mice(±S,n=10)

2.5毛蕊異黃酮對(duì)衰老小鼠腦組織中AChE活力的影響

乙酰膽堿(Ach)是膽堿能神經(jīng)介質(zhì),AChE活性升高,會(huì)造成腦內(nèi)ACh含量不足,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力下降甚至智力喪失[18]。如圖1所示,與正常對(duì)照組比較,衰老模型組小鼠腦中AChE活力明顯升高(p<0.01)。奧拉西坦組和毛蕊異黃酮不同劑量處理7 d天后,奧拉西坦組和毛蕊異黃酮低、中、高三種劑量組的AChE的活力明顯降低(p<0.05)。

圖1 毛蕊異黃酮對(duì)小鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.1 Effects of calycosin on AChE activities in brain tissue of mice(±S,n=10)

3 結(jié)論

D-半乳糖致衰老小鼠模型是目前應(yīng)用最多的衰老模型,長(zhǎng)期大量注射D-半乳糖,體內(nèi)產(chǎn)生的大量自由基會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生過(guò)氧化損害,引發(fā)免疫功能低下,細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖能力下降,發(fā)生退行性病變,動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶行為受到明顯損害,這些特征與自然衰老的表現(xiàn)基本吻合[17-18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可以是通過(guò)提高內(nèi)源抗氧化酶(T-SOD、GSH-Px)活力,降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度,減輕自由基對(duì)組織局部的損害,提高肝、脾、胸腺等器官機(jī)能,延緩了腦的萎縮和衰老,進(jìn)而提高了D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,該作用還可能與降低腦組織AchE活性有關(guān),其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入的研究。

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Mechanismsandeffectsofcalycosinonlearning-memoryfunctioninagingmice

YUDe-hong,WANGMei,CHENJin-ming,WANGXu,GENGZeng-yan,LIYing

(School of Pharmacy,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

Objective:The effects of calycosin on learning-memory behavior in aging mice induced byD-galactose were investigated in this study. Methods:The aging mice model was induced by subcutaneous injection ofD-galactose(150 mg·kg-1·d-1)were established after 6 weeks. TheD-galactose-induced aging mice were divided into model group,oxiracetam group(300 mg·kg-1·d-1),and calycosin high,medium and low dose treated-groups(20,12,7 mg·kg-1·d-1). Mice in the model group and normal control group were given normal saline. After intraperitoneal injection 7 d,the passive learning ability and memory capacity of mouse were investigated by the platform and the Y maze. Then organ index and antioxidant activity were detected,such as liver,spleen,thymus,brain and serum superoxide dismutase(T-SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),malondialdehyde(MDA)and brain acetylcholinesterase(AchE)activity. Results:Compared with the model group,in the Y maze,the number of correct reaction and active avoidance rate of calycosin-treated mice were significantly increased(p<0.05),and the escape period was significantly shortened and the number of errors in the step-down test was significantly reduced(p<0.05). Compared with the model group,liver,spleen,thymus and brain organ index of calycosin-treated mice were significantly different(p<0.05). In the calycosin groups,antioxidant enzyme(T-SOD,GSH-Px)activity was significantly elevated(p<0.05),MDA content was significantly reduced(p<0.05),and brain tissue AchE activity was decreased(p<0.05). Conclusion:Calycosin can improve the learning-memory function of aging mice induced byD-galactose. The mechanism may be to increase the endogenous antioxidant enzyme activity,reduce lipid peroxidation damage,protect organ function such as brain,spleen and thymus and reduce brain tissue AchE activity.

calycosin;D-galactose;organ index;antioxidation;anti-aging

2016-12-23

于德紅(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，E-mail:ydh613@163.com。

河北省教育廳項(xiàng)目(Z2011247)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0292-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.057