白中性均一多糖對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠降糖作用機制研究

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(廣東藥科大學中藥學院,國家中醫藥管理局嶺南藥材生產與開發重點研究室,廣東廣州 510006)

周露,楊慧文,程軒軒,張旭紅,潘育方,楊全*

(廣東藥科大學中藥學院,國家中醫藥管理局嶺南藥材生產與開發重點研究室,廣東廣州 510006)

目的:探討白簕中性均一多糖組分(ATP1-1)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的I型糖尿病小鼠的降糖作用及機制。方法:采用多次小劑量注射鏈脲佐菌素(MLD-STZ)的方法,建立C57BL/6小鼠I型糖尿病模型。成模小鼠隨機分成高血糖模型組、二甲雙胍組、ATP1-1高劑量組和ATP1-1低劑量組,以同周齡正常小鼠為正常對照組,每組10只,給藥4周。于給藥后檢測小鼠空腹血糖值(FBG)以及肝糖原含量,采用RT-PCR的方法測定肝臟中葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、葡萄糖轉運體2(GLUT2)mRNA表達水平。結果:與模型組相比,ATP1-1高、低劑量組的血糖均顯著下降(p<0.05),其中40 mg·kg-1ATP1-1給藥組血糖抑制率為 29.4%;兩劑量組均可有效增加糖尿病小鼠肝糖原含量(p<0.05);RT-PCR結果顯示,ATP1-1高、低劑量組GK mRNA、GLUT2 mRNA表達顯著增加(p<0.01),G6Pase mRNA表達降低(p<0.05)。結論:ATP1-1可以有效降低糖尿病小鼠血糖,該作用機制與調節糖代謝中的關鍵酶及相關轉運體有關。

白簕,多糖,降血糖,RT-PCR

糖尿病是一種血糖代謝紊亂的全身慢性代謝性疾病,是21世紀全球面臨的最嚴重、最危急的疾病之一。國際糖尿病聯盟(IDF)數據顯示,2015年全球糖尿病患者總數為4.15億,預計到2040年,該數字將增加至6.42億,全球醫療費用的12%將用于糖尿病治療,尋找開發糖尿病治療藥物已成為研究熱點[1]。

白簕(Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.)為五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopananx)攀援狀灌木,廣泛分布于我國中部和南部,嶺南地區資源豐富[2]。本品味苦、辛,性涼,具有疏風、消腫、止癢等功效[3]。文獻[4-9]研究表明,白簕化學成分主要涉及酚類、黃酮、多糖、萜類、揮發油等。本課題組前期研究發現白簕粗多糖及脫色后多糖具有明顯的降糖功效[10-11]。為深入探討其藥效物質基礎及降糖作用機制,本研究對白簕粗多糖進行分離純化,獲得含量較高的中性均一多糖ATP1-1,研究其對STZ誘導的I型糖尿病小鼠的糖代謝影響的相關機制,為白簕的資源深層次藥用開發利用奠定基礎。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

1 材料與方法

1.1材料與儀器

白簕 采自廣東恩平,經廣東藥科大學劉基柱副教授鑒定為五加科植物白簕(Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.),標本保存于廣東藥科大學中藥學院標本館;纖維素DE-52 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;鏈脲佐菌素(STZ) 批號:C1616118,aladdin公司;二甲雙胍 批號:1404031004,石家莊市普力制藥有限公司;Trizol 批號:108306,美國Invitrogen公司;6×loading buffer,DL 500 DNA Maker,primeScript RT-PCR kit試劑盒 寶生物大連有限公司;糖原檢測試劑盒 南京建成生物制品研究所;SPF級C57BL/6小鼠 雄性,體重20～22 g,動物許可證號:SCXK(粵)2013-0002,購于廣東省動物實驗中心;引物由上海生工合成;其余試劑 均為國產分析純。

FA1004型電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司;XW-80A型微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;HH-2型數顯恒溫水浴鍋 常州市澳華儀器有限公司;BGZ-30型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司;721型紫外分光光度計 上海精密儀器有限公司;安穩型血糖儀 三諾生物傳感技術有限公司;ST 16R冷凍離心機 美國Thermo公司;T100TMThermal cycler PCR、小型水平電泳槽 美國Bio-Rad公司;Tanon 1220凝膠成像系統 廣州譽維生物科技儀器有限公司;Nano-100微量分光光度計 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 白簕多糖的分離 取經脫色、脫蛋白處理后的白簕粗多糖適量,溶于蒸餾水,離心所得上清液通過DEAE-52纖維素柱(3.5 cm×60 cm)進行初步分離:依次用蒸餾水、0.05、0.2 mol·L-1的NaCl溶液進行分段洗脫,采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液中多糖含量并分別收集洗脫液,得到3個多糖組分。分別為含量較高的中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3。取適量凍干后的ATP1溶于1 mL去離子水中加入SephadexG-75層析柱,用去離子水洗脫,苯酚-硫酸法繪制洗脫曲線得到對稱單峰ATP1-1。ATP1-1采用高效滲透凝膠色譜法檢測純度和分子量,結果顯示ATP1-1為單一對稱峰,數均分子量Mn=2270,重均分子量Mw=2310,分布寬度D=1.02,以上結果證實ATP1-1為均一多糖。對ATP1-1進行富集,濃縮,冷凍干燥,儲存于-20 ℃。

1.2.2 動物造模與分組 小鼠適應性喂養3 d后,禁食12 h,腹腔注射STZ 50 mg·kg-1·d-1,連續注射5 d。STZ注射結束7 d后,檢測小鼠空腹血糖,檢測前禁食不禁水8 h,以血糖濃度高于11.1 mmol·L-1視為造模成功。

待模型穩定后,將成模小鼠隨機分成4組(n=10):高血糖模型組、二甲雙胍組、ATP1-1高劑量組、ATP1-1低劑量組,取未造模正常小鼠作為空白對照組。陽性對照組灌胃185 mg·kg-1二甲雙胍溶液,高、低劑量給藥組分別灌胃80、40 mg·kg-1ATP1-1溶液,模型組和正常組分別灌胃等體積的雙蒸水。連續給藥4周,給藥期間正常飲食,自由飲水。

1.2.3 空腹血糖的測定 末次給藥后,禁食不禁水8 h,測定各組小鼠的空腹血糖水平。并按照公式計算血糖抑制率:

血糖抑制率(%)=(給藥前空腹血糖值-給藥結束后空腹血糖值)/給藥前空腹血糖值×100

1.2.4 檢測肝糖原含量 末次給藥后,解剖小鼠,取肝臟保存于-80 ℃待測。按試劑盒說明書操作測定肝糖原含量。

1.2.5 RT-PCR檢測肝臟中GK、G6Pase、GLUT2 mRNA表達 Trizol RNA抽提試劑盒提取肝臟中總RNA,測定總RNA純度和含量。以提取總RNA為模板,按照反轉錄試劑盒說明反轉錄cDNA,反應條件:30 ℃,10 min;42 ℃,30 min;95 ℃,5 min,合成后的cDNA 4 ℃保存。

表3 ATP1-1對小鼠糖尿病的肝糖原影響Table 3 Effect of ATP1-1 on hepatic glycogen of diabetic model mice(±s,n=10)

注:與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01;與正常組相比,#p<0.05,##p<0.01。

PCR引物序列見表1,PCR擴增按試劑盒說明書操作,上機進行PCR擴增,反應條件:94 ℃預變性1 min,94 ℃變性30 s,退火(溫度見表1)30 s,72 ℃延伸30 s,循環數見表1,所得擴增產物4 ℃保存。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像儀觀察,并用Imagej軟件對條帶進行灰度分析,以β-actin基因表達量為內參照,比較分析GK mRNA、G6Pase mRNA、GLUT2 mRNA基因的表達水平。

2 結果與分析

2.1 ATP1-1對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

由表2可知,給藥前,各組的糖尿病小鼠空腹血糖水平均大于11.1 mmol/L,視為造模成功;給藥4周,模型組血糖比較穩定,二甲雙胍組和ATP1-1各劑量組血糖均有降低。二甲雙胍組、ATP1-1高、低劑量組血糖抑制率分別為25.78%、17.7%、29.4%,其中40 mg·kg-1低劑量組血糖值與高糖組相比有極顯著性差異(p<0.01),說明ATP1-1對STZ誘導的糖尿病小鼠有較好的降血糖作用。

表2 ATP1-1對糖尿病小鼠血糖影響Table 2 Effect of ATP1-1 on blood glucose of diabetic mice(±s,n=10)

注:與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.2 ATP1-1對糖尿病小鼠肝糖原含量的影響

由表3可知,模型組小鼠肝糖原含量明顯低于正常組(p<0.05)。給藥4周后,與模型組相比,二甲雙胍組、80、40 mg·kg-1ATP1給藥組小鼠肝糖原含量均明顯上升(p<0.05),其中40 mg·kg-1低劑量組與模型組組相比,呈現極顯著性差異(p<0.01);給藥組與二甲雙胍組肝糖原無明顯差異,說明ATP1-1可以較好地促進糖尿病小鼠肝糖原的合成。

2.3 ATP1-1對糖尿病小鼠GK、G6Pase、GLUT2 mRNA表達的影響

由圖1結果可知,給藥4周后,與模型組比,各組GK及GLUT2 mRNA表達水平顯著升高(p<0.01),同時,G6Pase mRNA表達水平顯著降低(p<0.05)。2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示GK、G6Pase、GLUT2和β-actin的擴增產物相應在101、128、136、188 bp附近有清晰的目的基因和內參基因PCR擴增帶,與相應設計的擴增長度相符,未見其他擴增產物,見圖2。

圖1 各組小鼠肝臟中GK、G6Pase、GLUT2表達水平Fig.1 mRNA expression levels of GK、G6Pase、GLUT2 in liver of diabetic model mice注:與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01;與正常組相比,#p<0.05,##p<0.01。

3 討論

本實驗采用的MLD-STZ糖尿病小鼠模型,與人類T1DM發病機理相似,死亡率低,發病率高,血糖穩定[12],是目前比較理想的Ⅰ型糖尿病模型制備方法。課題組前期研究發現白簕粗多糖具有較好的降血糖作用,在此基礎上,本論文對白簕多糖進行系統分離,獲得含量較高的中性均一多糖ATP1-1,并對ATP1-1的降糖藥效進行深入研究。

肝臟是葡萄糖代謝的主要器官之一[13],當血糖升高時,肝臟將葡萄糖轉化為肝糖原,降低血糖;當血糖過低時,通過糖異生的方式來產生葡萄糖,使血糖維持穩定。本實驗結果表明,ATP1-1可以有效增加糖尿病小鼠肝糖原含量,推測其可能通過促進肝臟對葡萄糖的轉化,從而達到降血糖的效果。

圖2 2%瓊脂糖凝膠電泳產物圖Fig.2 2% agarose gel electrophoresis of PCR products注:A:GK;B:G6Pase;C:GLUT2;D:β-actin。M:Marker;1:正常組;2:模型組;3:二甲雙胍組;4:低劑量組;5:高劑量組。

GK是糖代謝中的關鍵酶,催化葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖,促進肝糖原的合成,從而降低血糖。G6Pase是肝臟糖異生的關鍵酶,催化糖異生的最后一步6-磷酸葡萄糖轉化為葡萄糖,當G6Pase表達下降時,糖異生減弱,血糖下降。GLUT2是肝臟最主要的葡萄糖轉運體,運送葡萄糖進出肝臟,與GK協調作用使胰島素分泌反應的強度受血中葡萄糖濃度的調節[14]。有研究表明二甲雙胍主要通過增加對葡萄糖的利用、抑制肝臟糖異生來降低糖尿病小鼠血糖,增加肝糖原含量[15]。本研究發現二甲雙胍可有效增加GK、GLUT2的表達,降低G6Pase含量,與二甲雙胍的降糖機制相符,說明該研究方法可行。ATP1-1給藥4周后,給藥組動物的GK、GLUT2表達增加(p<0.01),G6Pase表達下降(p<0.05),表明ATP1-1可通過提高GLUT2和GK表達,降低G6Pase表達,從而促進葡萄糖在肝臟中的轉化,抑制糖異生,最終達到降低血糖的作用,由此推斷參與糖代謝的調節是ATP1-1的降糖機制之一。

4 結論

本研究采用STZ誘導的小鼠糖尿病模型,探究白簕中性均一多糖ATP1-1組分的降糖機制。實驗結果表明,ATP1-1低(40 mg·kg-1)、高(80 mg·kg-1)劑量組均可有效地降低糖尿病小鼠血糖,并提高肝糖原含量。同時,ATP1-1低、高劑量組均可上調糖尿病小鼠GK、GLUT2的表達,下調G6Pase的表達。據此,推測ATP1-1為白簕多糖降糖的有效活性物質之一,其降糖機制與調節糖代謝中的關鍵酶及相關轉運體有關。

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StudyonhypoglycemiceffectandthemechanismofaneutralhomogeneouspolysaccharidefromAcanthopanaxtrifoliatus
onstreptozotocin-induceddiabeticmice

ZHOULu,YANGHui-wen,CHENGXuan-xuan,ZHANGXu-hong,PANYu-fang,YANGQuan*

(Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Production & Development of Cantonese Medicinal Materials,School of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Objective:To investigate the hypoglycemic effect and mechanism of a neutral homogeneous polysaccharide fromAcanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.(ATP1-1)on typeⅠdiabetic mice induced by STZ. Methods:TypeⅠdiabetic animal model of C57BL/6 mice was established by multiple intraperitoneal injection of low dose streptozotocin(MLD-STZ). Diabetic mice were randomly divided into hyperglycemia group,positive control group of metformin,high-dose and low-dose groups of ATP1-1. Normal mice were used as blank control,10 mice for each group. The above components were administered intragastrically for 4 weeks. Hepatic glycogen and fasting blood glucose were determined at the end of administration. The mRNA expression of GK,G6Pase,GLUT2 were also observed by RT-PCR assay. Results:Compared with hyperglycemia group,FBG levels of the drug groups(high-dose and low-dose of ATP1-1)were decreased after 4 weeks’ administration(p<0.05),meanwhile,hepatic glycogen content of the drug groups were increased(p<0.05). The inhibition rate of blood glucose for 40 mg·kg-1dose group was 29.4%. RT-PCR results showed that ATP1-1 could increase the mRNA expressions of GK and GLUT2(p<0.01),while reduce the mRNA expression of G6Pase(p<0.05). Conclusion:ATP1-1 could decrease the blood glucose of type I diabetic mice,regulation of glycometabolism might be one of the mechanisms.

Acanthopanaxtrifoliatus;polysaccharide;antihyperglycemic;RT-PCR

2017-02-20

周露(1992-)，女，碩士，研究方向：中藥有效成分與藥理活性研究，E-mail:zhoulu_92@163.com。

*通訊作者:楊全(1972-)，男，博士，教授，研究方向：中藥資源，E-mail：yangquan7208@vip.163.com。

國家自然科學基金項目(81503217)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0288-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.056